發(fā)布時間：2020-06-23 00:31

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是導致奶牛乳房炎的主要致病菌之一,引起的抗生素耐藥性和慢性炎癥問題日益突出。作為疾病控制的新策略,抗菌肽通常是由動物細胞天然產生的,幾乎對所有類別的病原體有效且極難產生抗性。丁酸鈉不僅是一種短鏈脂肪酸類營養(yǎng)化合物,還是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)。有研究報道稱丁酸鈉能通過HDACi作用誘導動物內源性抗菌肽表達,同時還能發(fā)揮抑菌抗炎的作用效果,但其確切分子機制尚不清楚。因此,本研究通過全面了解丁酸鈉對動物內源性抗菌肽誘導表達的影響以及明確丁酸鈉對炎癥相關信號通路的調控機制,為有效預防和控制金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎提供了分子領域的理論依據。本研究以牛乳腺上皮細胞(MAC-T)為細胞模型。首先,觀察丁酸鈉對細胞內源性抗菌肽基因表達的誘導效果。接著,利用基因轉錄組學查找并驗證關鍵轉錄因子、細胞信號轉導通路及microRNA對丁酸鈉調控細胞內源性抗菌肽基因表達的影響。然后,觀察丁酸鈉在金黃色葡萄球菌感染細胞中的抑菌效果。最后,闡明丁酸鈉緩解金黃色葡萄球菌外毒素脂磷壁酸(LTA)引起細胞炎癥反應的信號轉導機制。主要試驗結果如下:(1)研究結果表明丁酸鈉能上調MAC-T細胞內源性抗菌肽的表達,包括β-defensin類抗菌肽DEFB1、DEFB3、DEFB4、DEFB5、DEFB6、DEFB8、DEFB9、DEFB10、DEFB11、DEFB12、DEFB13、LAP、TAP、BPTI和EBD,以及cathelicidin類抗菌肽Bac1、Bac5、Indolicidin、BMAP-28、BMAP-27和BMAP-34。抗菌肽基因以劑量和時間依賴性方式被丁酸鈉誘導,其中以DEFB1和BMAP-34的表現最為顯著。丁酸鈉以劑量依賴性方式上調了MAC-T細胞組蛋白乙�；�,并對DEFB5、Indolicidin和BMAP-34基因的誘導表達能力均高于曲古霉素(TSA)。MAC-T細胞各表達了GPR41和GPR43的牛同源受體蛋白和mRNA,丁酸鈉處理后其表達量均上調。利用特異性siRNA分別沉默GPR41和GPR43均不同程度地減弱了丁酸鈉誘導DEFB5、DEFB10和BMAP-34基因上調表達,以DEFB10的減弱效果最為顯著。(2)基因轉錄組測序結果表明EBD、TAP、DEFB5、DEFB1、DEFB4、LAP和BMAP-34基因均出現了上調差異表達,實時定量PCR驗證了該結果。所評估的抗菌肽基因啟動子上游區(qū)域均預測出了AP-1和DBP兩個轉錄因子的轉錄結合位點。抑制p38和NF-κB途徑分別下調了丁酸鈉誘導的BMAP-34和DEFB1基因表達水平。抑制ERK途徑下調了丁酸鈉誘導的BMAP-34表達,但卻上調了DEFB1表達,與之相反,抑制JNK途徑上調了丁酸鈉誘導的BMAP-34表達,同時下調了DEFB1表達。Western blot結果表明bta-miR-677對MAC-T細胞組蛋白乙�；酗@著的正調節(jié)作用,而bta-miR-2440對其沒有顯著影響。bta-miR-677對MAC-T細胞BMAP-34和DEFB1基因起上調表達作用,bta-miR-2440只在丁酸鈉誘導BMAP-34基因表達中起抑制作用。(3)丁酸鈉以濃度和時間依賴性方式抑制金黃色葡萄球菌感染MAC-T細胞。透射電鏡觀察結果表明丁酸鈉降低了金黃色葡萄球菌感染MAC-T亞細胞結構的破壞程度。金黃色葡萄球菌感染增加了MAC-T細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR2、NOD1和NOD2基因表達,而預處理丁酸鈉減弱了這些增加。隨著金黃色葡萄球菌感染MAC-T細胞時間增加,BMAP-34和TAP基因表達也隨之增加,預處理丁酸鈉后,BMAP-34和TAP基因表達隨細菌感染時間增加而出現進一步地上調。丁酸鈉顯著地減輕了金黃色葡萄球菌感染小鼠乳腺組織所引起的病理性損傷和炎癥反應。(4)丁酸鈉顯著上調了MAC-T細胞組蛋白H3乙�；胶虰MAP-34、TAP、DEFB1、DEFB5抗菌肽基因表達量,LTA單獨刺激MAC-T細胞沒有顯著上調組蛋白乙�；�,預處理丁酸鈉后LTA刺激MAC-T細胞進一步上調了組蛋白乙�；胶涂咕幕虮磉_量。預處理丁酸鈉抑制了LTA誘導的MAC-T細胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達,增強了IL-10基因表達。LTA顯著誘導了NF-κB p65亞基的活化和IκBα的降解,預處理丁酸鈉降低了LTA所誘導的NF-κB p65和IκBα磷酸化水平并減少了NF-κB p65的核易位。丁酸鈉顯著增強了LTA誘導的MAC-T細胞中p38和ERK磷酸化蛋白表達水平,同時減弱了JNK、AMPKα和ACCα磷酸化蛋白表達水平。LTA刺激MAC-T細胞后TLR2、NLRP3、ASC和caspase-1、IL-1β的蛋白表達水平均顯著增加,這種增加通過MAC-T細胞預處理丁酸鈉而被減弱�？傊�,本研究證實了丁酸鈉能誘導牛乳腺上皮細胞(MAC-T)內源性抗菌肽基因上調表達,HDACi、短鏈脂肪酸受體GPR41/GPR43、NF-κB途徑、MAPKs途徑和microRNA參與了抗菌肽基因表達的調控。同時,丁酸鈉在金黃色葡萄球菌感染和LTA刺激的MAC-T細胞中發(fā)揮了抑菌抗炎作用,其作用與抑制TLR2/NF-κB/NLRP3途徑和增強內源性抗菌肽基因表達有關。
【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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本文編號：2726496