【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要致病菌之一,引起的抗生素耐藥性和慢性炎癥問(wèn)題日益突出。作為疾病控制的新策略,抗菌肽通常是由動(dòng)物細(xì)胞天然產(chǎn)生的,幾乎對(duì)所有類(lèi)別的病原體有效且極難產(chǎn)生抗性。丁酸鈉不僅是一種短鏈脂肪酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng)化合物,還是一種組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)。有研究報(bào)道稱(chēng)丁酸鈉能通過(guò)HDACi作用誘導(dǎo)動(dòng)物內(nèi)源性抗菌肽表達(dá),同時(shí)還能發(fā)揮抑菌抗炎的作用效果,但其確切分子機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過(guò)全面了解丁酸鈉對(duì)動(dòng)物內(nèi)源性抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)的影響以及明確丁酸鈉對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,為有效預(yù)防和控制金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎提供了分子領(lǐng)域的理論依據(jù)。本研究以牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)為細(xì)胞模型。首先,觀察丁酸鈉對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性抗菌肽基因表達(dá)的誘導(dǎo)效果。接著,利用基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)查找并驗(yàn)證關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及microRNA對(duì)丁酸鈉調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性抗菌肽基因表達(dá)的影響。然后,觀察丁酸鈉在金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞中的抑菌效果。最后,闡明丁酸鈉緩解金黃色葡萄球菌外毒素脂磷壁酸(LTA)引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)研究結(jié)果表明丁酸鈉能上調(diào)MAC-T細(xì)胞內(nèi)源性抗菌肽的表達(dá),包括β-defensin類(lèi)抗菌肽DEFB1、DEFB3、DEFB4、DEFB5、DEFB6、DEFB8、DEFB9、DEFB10、DEFB11、DEFB12、DEFB13、LAP、TAP、BPTI和EBD,以及cathelicidin類(lèi)抗菌肽Bac1、Bac5、Indolicidin、BMAP-28、BMAP-27和BMAP-34�？咕幕蛞詣┝亢蜁r(shí)間依賴(lài)性方式被丁酸鈉誘導(dǎo),其中以DEFB1和BMAP-34的表現(xiàn)最為顯著。丁酸鈉以劑量依賴(lài)性方式上調(diào)了MAC-T細(xì)胞組蛋白乙�；�,并對(duì)DEFB5、Indolicidin和BMAP-34基因的誘導(dǎo)表達(dá)能力均高于曲古霉素(TSA)。MAC-T細(xì)胞各表達(dá)了GPR41和GPR43的牛同源受體蛋白和mRNA,丁酸鈉處理后其表達(dá)量均上調(diào)。利用特異性siRNA分別沉默GPR41和GPR43均不同程度地減弱了丁酸鈉誘導(dǎo)DEFB5、DEFB10和BMAP-34基因上調(diào)表達(dá),以DEFB10的減弱效果最為顯著。(2)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明EBD、TAP、DEFB5、DEFB1、DEFB4、LAP和BMAP-34基因均出現(xiàn)了上調(diào)差異表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了該結(jié)果。所評(píng)估的抗菌肽基因啟動(dòng)子上游區(qū)域均預(yù)測(cè)出了AP-1和DBP兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。抑制p38和NF-κB途徑分別下調(diào)了丁酸鈉誘導(dǎo)的BMAP-34和DEFB1基因表達(dá)水平。抑制ERK途徑下調(diào)了丁酸鈉誘導(dǎo)的BMAP-34表達(dá),但卻上調(diào)了DEFB1表達(dá),與之相反,抑制JNK途徑上調(diào)了丁酸鈉誘導(dǎo)的BMAP-34表達(dá),同時(shí)下調(diào)了DEFB1表達(dá)。Western blot結(jié)果表明bta-miR-677對(duì)MAC-T細(xì)胞組蛋白乙�；酗@著的正調(diào)節(jié)作用,而bta-miR-2440對(duì)其沒(méi)有顯著影響。bta-miR-677對(duì)MAC-T細(xì)胞BMAP-34和DEFB1基因起上調(diào)表達(dá)作用,bta-miR-2440只在丁酸鈉誘導(dǎo)BMAP-34基因表達(dá)中起抑制作用。(3)丁酸鈉以濃度和時(shí)間依賴(lài)性方式抑制金黃色葡萄球菌感染MAC-T細(xì)胞。透射電鏡觀察結(jié)果表明丁酸鈉降低了金黃色葡萄球菌感染MAC-T亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度。金黃色葡萄球菌感染增加了MAC-T細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR2、NOD1和NOD2基因表達(dá),而預(yù)處理丁酸鈉減弱了這些增加。隨著金黃色葡萄球菌感染MAC-T細(xì)胞時(shí)間增加,BMAP-34和TAP基因表達(dá)也隨之增加,預(yù)處理丁酸鈉后,BMAP-34和TAP基因表達(dá)隨細(xì)菌感染時(shí)間增加而出現(xiàn)進(jìn)一步地上調(diào)。丁酸鈉顯著地減輕了金黃色葡萄球菌感染小鼠乳腺組織所引起的病理性損傷和炎癥反應(yīng)。(4)丁酸鈉顯著上調(diào)了MAC-T細(xì)胞組蛋白H3乙酰化水平和BMAP-34、TAP、DEFB1、DEFB5抗菌肽基因表達(dá)量,LTA單獨(dú)刺激MAC-T細(xì)胞沒(méi)有顯著上調(diào)組蛋白乙�；�,預(yù)處理丁酸鈉后LTA刺激MAC-T細(xì)胞進(jìn)一步上調(diào)了組蛋白乙�；胶涂咕幕虮磉_(dá)量。預(yù)處理丁酸鈉抑制了LTA誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因表達(dá),增強(qiáng)了IL-10基因表達(dá)。LTA顯著誘導(dǎo)了NF-κB p65亞基的活化和IκBα的降解,預(yù)處理丁酸鈉降低了LTA所誘導(dǎo)的NF-κB p65和IκBα磷酸化水平并減少了NF-κB p65的核易位。丁酸鈉顯著增強(qiáng)了LTA誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞中p38和ERK磷酸化蛋白表達(dá)水平,同時(shí)減弱了JNK、AMPKα和ACCα磷酸化蛋白表達(dá)水平。LTA刺激MAC-T細(xì)胞后TLR2、NLRP3、ASC和caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)水平均顯著增加,這種增加通過(guò)MAC-T細(xì)胞預(yù)處理丁酸鈉而被減弱�？傊�,本研究證實(shí)了丁酸鈉能誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)內(nèi)源性抗菌肽基因上調(diào)表達(dá),HDACi、短鏈脂肪酸受體GPR41/GPR43、NF-κB途徑、MAPKs途徑和microRNA參與了抗菌肽基因表達(dá)的調(diào)控。同時(shí),丁酸鈉在金黃色葡萄球菌感染和LTA刺激的MAC-T細(xì)胞中發(fā)揮了抑菌抗炎作用,其作用與抑制TLR2/NF-κB/NLRP3途徑和增強(qiáng)內(nèi)源性抗菌肽基因表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2726496