【摘要】：電針(Electroacupuncture,EA)是一種治療疼痛的有效方法。通過傳統(tǒng)物理和藥理學(xué)手段已經(jīng)確定許多參與針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)核團和區(qū)域,但單個核團或區(qū)域并不能闡明針刺鎮(zhèn)痛的神經(jīng)機制,針刺鎮(zhèn)痛激活的神經(jīng)環(huán)路還有待研究。大量的研究表明電針可以誘導(dǎo)多種鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽等)和抗鎮(zhèn)痛物質(zhì)(如膽囊收縮素、孤啡肽、血管緊張素Ⅱ等)的釋放。顯然,針刺鎮(zhèn)痛是中樞多種物質(zhì)共同作用的綜合表現(xiàn)。由于在不同神經(jīng)核團中神經(jīng)元功能各異,神經(jīng)元內(nèi)信號分子參與調(diào)節(jié)針刺鎮(zhèn)痛的機制還不清楚。因此,本研究旨在探索針刺鎮(zhèn)痛的相關(guān)神經(jīng)環(huán)路、物質(zhì)及分子信號通路。1.針刺不同穴位激活的共同神經(jīng)環(huán)路為探索針刺鎮(zhèn)痛的相關(guān)神經(jīng)環(huán)路,本研究通過標(biāo)記激活的神經(jīng)元,比較分析針刺不同穴位激活的中樞神經(jīng)核團或區(qū)域。選取28只雜交雄性山羊(30±2 kg),隨機分為四組:空白對照組,“百會-三臺”假針組,“百會-三臺”電針組,雙側(cè)后三里電針組。電針組山羊電針1次(60 Hz,30 min);對照組山羊僅做保定處理;假針組山羊只扎針、不通電。采用鉀離子透入法測定山羊痛閾。記錄電針前后的山羊痛閾值,計算痛閾變化率。待測痛后山羊迅速處死,采取大腦和脊髓組織樣。采用免疫酶組織化學(xué)方法檢測尾核、伏核、外側(cè)隔區(qū)、內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦室旁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、基底杏仁核、僵核、臂旁核、藍斑、孤束核、垂體、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)(vlPAG)、中縫大核(NRM)、巨細胞網(wǎng)狀核(Gi)和脊髓背角(SCDH)中c-Fos蛋白表達水平。試驗結(jié)果顯示,“百會-三臺”和后三里電針組山羊痛閾在電針后顯著升高(p0.05)�！鞍贂�-三臺”電針組山羊的痛閾變化率顯著高于后三里電針組(p0.05)。與空白組相比,電針后三里或“百會-三臺”組穴都能誘導(dǎo)c-Fos免疫樣陽性神經(jīng)元在內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、基底杏仁核、韁核、垂體前葉、臂旁核、藍斑、vlPAG、NRM、Gi和SCDH內(nèi)顯著增加(p0.05)。與后三里電針組相比,電針“百會-三臺”組穴誘導(dǎo)c-Fos免疫樣陽性神經(jīng)元在基底杏仁核內(nèi)顯著增加(p0.05),但在內(nèi)側(cè)隔區(qū)、下丘腦室旁核、韁核和SCDH內(nèi)顯著減少(p0.05)。這些結(jié)果提示弓狀核-中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)-中縫大核/藍斑-脊髓背角和下丘腦-垂體是電針不同穴位激活的共同神經(jīng)環(huán)路。2.電針山羊中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)基因差異表達為全面了解電針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因表達的影響,本研究采取電針山羊PAG進行轉(zhuǎn)錄組高通量深度測序,運用q PCR方法對測序結(jié)果進行驗證,并通過側(cè)腦室微注射技術(shù)進一步研究差異基因胸腺素β4在電針鎮(zhèn)痛中的作用。選取三對純種波爾山羊(30±2 kg),按照配對試驗方法進行同窩配對,每對山羊中一只接受電針為電針組,另一只接受對照處理為對照組。電針組山羊接受1次電針(60Hz,30min)。采用鉀離子透入法測定山羊痛閾。記錄電針前和電針0 h和4 h后的山羊痛閾,計算痛閾變化率。在4 h測完痛閾后,6只山羊迅速處死,取PAG分別進行測序建庫。利用生物信息學(xué)方法對電針組與對照組的差異表達基因進行功能富集分析。在q PCR驗證試驗中,選取測序結(jié)果中表達量高的15個差異基因進行驗證。選取差異基因胸腺素β4進行進一步研究。在探索胸腺素β4(Tβ4)在電針鎮(zhèn)痛中的作用試驗中,分別建立生理模型和炎癥模型進行側(cè)腦室注射。在生理模型試驗中,選取72只SD大鼠(250±20 g)隨機分為兩組(n=36),即電針組與對照組,各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射1μg/μL Tβ4、0.1μg/μL Tβ4、0.01μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-si RNA(Tβ4沉默用si RNA)、Lip-C-si RNA(negative si RNA)或PBS(每6只大鼠注射同一種藥物)。注射后,電針組大鼠接受1次電針。每組大鼠注射前和電針后測定鼠甩尾反射時間(TFL),計算TFL變化率。在炎癥模型試驗中,選取54只SD大鼠(250±20 g)隨機分為三組,即炎癥電針組(CFA+EA,n=24)、炎癥對照組(CFA+CON,n=24)和生理對照組(Saline+CON,n=6)。CFA+EA或CFA+CON組大鼠足底注射CFA(0.1m L/只),各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射0.1μg/μL Tβ4、Lip-Tβ4-si RNA、Lip-C-si RNA或PBS注射(每6只大鼠注射同一種藥物)。生理對照組大鼠足底注射生理鹽水(0.1m L/只),側(cè)腦室注射PBS。CFA+EA組分別于0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d和13 d施予電針。所有大鼠于足底注射藥物前和注射后1 d、3 d、7 d、14 d測定足底機械痛閾(PWT),計算PWT痛閾變化率。結(jié)果顯示,電針后電針組山羊痛閾顯著高于對照組山羊痛閾(p0.05)。測序分析得到2651個差異表達基因(DEGs),其中1709個基因上調(diào),852個基因表達下調(diào)。這些差異基因富集在30條KEGG pathways和149條GO terms。進一步q PCR驗證結(jié)果顯示,甲硫腦啡肽、阿黑皮素原、前強啡肽原、κ-阿片肽受體、谷氨酸受體、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體1、γ氨基丁酸B型受體、酸性纖維蛋白、芳香族氨基酸脫羧酶、突觸結(jié)合蛋白1、安定綁定蛋白、前蛋白轉(zhuǎn)換酶1抑制劑、胸腺素β4、胸腺素β10和前列腺F合酶基因的表達趨勢與高通量測序結(jié)果一致,驗證了測序結(jié)果的可靠性。測序結(jié)果提示,電針上調(diào)的谷氨酸受體及轉(zhuǎn)運體、γ氨基丁酸受體及轉(zhuǎn)運體、絲裂原激活的蛋白激酶、突觸結(jié)合蛋白可能通過谷氨酸能突觸、γ氨基丁酸能突觸、MAPK、核糖體、泛素蛋白體等途徑參與調(diào)節(jié)針刺鎮(zhèn)痛。生理模型側(cè)腦室注射結(jié)果顯示,EA+Tβ4組大鼠TFL顯著低于EA+PBS組大鼠TFL(p0.05)。在炎性模型中,CFA+EA+Tβ4組大鼠PWT在注射CFA后第1 d、7 d和14 d都顯著低于CFA+EA+PBS組大鼠PWT(p0.05)。CFA+EA+Lip-Tβ4-si RNA組大鼠PWT在注射CFA后第1 d、3 d、7 d和14 d都顯著低于CFA+EA+PBS組大鼠PWT(p0.05)。提示Tβ4在生理和炎癥情況下都參與調(diào)節(jié)電針鎮(zhèn)痛。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S853.6
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文2.5 電針本試驗選取 百會-三臺 組穴和雙側(cè)后三里組穴作為電針山羊的穴位。這三個穴位的解剖位置在獸醫(yī)針灸研究中有詳細的描述(Cheng et al 2013; Liu et al 2009;Qiu et al 2015)。百會穴位于最后腰椎與第一薦椎棘突之間的凹陷處，經(jīng)皮垂直進針到達脊硬膜外，一般進針 3 cm，針直徑 0.40 mm 長 50 mm；三臺穴位于第四、五胸椎棘突之間的凹陷處，正中一穴，經(jīng)皮進針向前下方 20~30°角，斜刺入 4~5 cm，針直徑為 0.45 mm 長 75 mm。后三里穴位于小腿外側(cè)上部，即腓骨小頭下方、趾長伸肌與趾外側(cè)伸肌的肌溝內(nèi)，左右各一穴，經(jīng)皮向腓骨間隙刺入 2~3 cm, 針直徑為 0.40mm 長 50 mm，如圖 2-1 所示。于試驗日上午 8:00，山羊采取俯臥保定姿勢，用 60 Hz，3.2 V 電針刺激山羊 0.5 h 。假針組山羊百會和三臺穴位插針不通電。

圖 2-2 腦組織塊分割Fig.2-2 Brain sectionalizationH0: 耳間水平面。A35、A30、A25、A20、A15、A10、A5、0、P5、P10、P15 和 P20 分別表示吻側(cè)端距離對耳線 35 mm、30 mm、25 mm、20 mm、15 mm、10 mm、5 mm 和 0 mm，尾端距離對耳線 5 mm、10 mm、15 mm 和 20 mm 的橫截面。各神經(jīng)核團與腦區(qū)在腦中所處的前后位置如圖標(biāo)，包括：尾核（CAU）、伏核（ACB）、隔區(qū)（SN）、下丘腦室旁核（PVH）、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（VMH）、弓狀核（ARC）、杏仁核（AMY）、韁核（HB）、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）、臂旁核（PBN）、藍斑（LC）、中縫大核（NRM）、巨細胞網(wǎng)狀核（GI）、孤束核（NTS）。標(biāo)注適用于圖 2-3。H0: the horizontal zero plane. A35, A30, A25, A20, A15, A10, A5, and 0 show transverse planes at 3530, 25, 20, 15, 10, 5, and 0mm rostral to the interaural line, and P5, P10, P15, and P20 show transverseplanes at 5, 10, 15, and 20mm caudal to the interaural line, respectively. The nuclei and areasidentified include the nuclei or areas to be observed were the caudate nucleus (CAU), the nucleusaccumbens (ACB), the septal nucleus (SN), the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVH),the ventromedial nucleus of the hypothalamus (VMH), the arcuate nucleus (ARC), and the amygdala(AMY), the nucleus habenula (HB), the periaqueductal grey (PAG), the parabrachial nucleus (PBN),

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