【摘要】：[目的]酮病奶牛血液里游離脂肪酸(NEFA)顯著增加,而棕櫚酸(PA)是NEFA的主要成分。此試驗旨在通過體外培養(yǎng)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞(BEND),檢測PA誘導(dǎo)BEND細(xì)胞的氧化損傷并探究原花青素(PC)作為抗氧化劑對Nrf2/ARE通路的影響及協(xié)助BEND細(xì)胞抵抗PA引發(fā)的氧化損傷作用機制,為進(jìn)一步深入研究酮病以及PA和PC對奶牛生殖機能的作用機制奠定基礎(chǔ)。[方法]通過添加PA和PC在6h,12h,24h,48h等不同時間點分別進(jìn)行單獨及聯(lián)合培養(yǎng)BEND細(xì)胞,并運用CCK-8法檢測BEND細(xì)胞的活力,之后分別采取其各自的試劑盒對過氧化氫酶(CAT),還原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)等氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測,最后采用熒光定量PCR及Western-blot檢測與細(xì)胞核有關(guān)的因子(Nrf2)及Nrf2/ARE通路調(diào)控其下游血紅素氧合酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)、谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)、以及超氧化物歧化酶(SOD)的mRNA及蛋白表達(dá)量,探究PC對PA誘導(dǎo)BEND細(xì)胞氧化損傷的防護(hù)機制。[結(jié)果]1.通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn):當(dāng)PA的濃度在100-300μmol/L時,BEND細(xì)胞的活力變化不顯著(P0.05),當(dāng)PA的濃度為400μmol/L時,BEND細(xì)胞的活力顯著下降(P0.05),當(dāng)PA的濃度高于600μmol/L,BEND細(xì)胞的活力下降的極其顯著(P0.01);當(dāng)PC的濃度不足10μmol/L時,對BEND細(xì)胞起到保護(hù)的作用,一旦其高于10μmol/L后,BEND細(xì)胞就會受到抑制,并且隨著濃度的升高,影響就更加明顯;當(dāng)PA、PC聯(lián)合作用于BEND細(xì)胞時,PC能夠拮抗PA誘導(dǎo)的氧化損傷。并在不同時間點加藥后發(fā)現(xiàn)24h的作用結(jié)果最佳。2.通過對CAT,GSH,GSH-PX,MDA,SOD和T-AOC等氧化指標(biāo)的檢測得出:相較于空白組,PA組BEND細(xì)胞的CAT活力明顯下降(P0.05);GSH含量,GSH-PX,SOD,T-AOC活力顯著降低(P0.01),MDA含量顯著升高(P0.01);PC組BEND細(xì)胞的CAT,SOD,T-AOC活力顯著升高(P0.05);GSH含量,GSH-PX,活力顯著升高(P0.01),MDA含量顯著降低(P0.05);PA+PC聯(lián)合組對比于其對應(yīng)PA組,CAT活力略微提升,T-AOC活力得到提高(P0.05),GSH含量以及GSH-PX,SOD活力極顯著升高(P0.01);MDA含量下降明顯(P0.05),表明PC能夠拮抗PA誘導(dǎo)BEND產(chǎn)生的細(xì)胞損傷。3.通過熒光定量PCR測定BEND細(xì)胞的mRNA表明與空白組相比,PA組的Nrf2、GCLC基因的mRNA表達(dá)量有所升高,但效果不顯著;NQO1基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.05);HO-1基因的mRNA表達(dá)量極顯著升高(P0.01);而SOD基因的mRNA表達(dá)量略微降低。PC組Nrf2和SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.05),GCLC,NQO1和HO-1基因的mRNA表達(dá)量極顯著升高(P0.01)。PA與PC聯(lián)合組相較于PA組而言,Nrf2、GCLC的mRNA表達(dá)量有所提升但效果不明顯,NQO1,HO-1和SOD基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.05)。4.通過Western blot對BEND蛋白的產(chǎn)量檢測發(fā)現(xiàn),除了NQO1的PC與空白組相比其含量顯著上升(P0.05)外,剩余各組只呈現(xiàn)升高和減少的態(tài)勢。SOD的PA組與空白組相其含量略微下降外,剩下的Nrf2,GCLC,HO-1,NQO1基因無論PA組,PC組還是PA+PC聯(lián)合組與空白組相比其蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢。[結(jié)論]棕櫚酸能夠誘導(dǎo)BEND細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷,原花青素可以激活Nrf2/ARE通路調(diào)控其靶基因,拮抗棕櫚酸誘發(fā)的氧化損傷,達(dá)到防護(hù)效果。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.23
【圖文】：

第二章 原花青素對棕櫚酸致 BEND 細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響2.2 試驗結(jié)果2.2.1 BEND 細(xì)胞不同時間點的生長情況如下圖 1-6 分別為 BEND 細(xì)胞傳代前以及傳代后 0h，6h，12h，24h，48h的細(xì)胞生長狀況。從圖中可以看出細(xì)胞傳代后 0-12h 細(xì)胞的貼壁量較少，24h 時可達(dá)到 80%-90%的貼壁量，48h 時基本貼滿。

第二章 原花青素對棕櫚酸致 BEND 細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響2.2 試驗結(jié)果2.2.1 BEND 細(xì)胞不同時間點的生長情況如下圖 1-6 分別為 BEND 細(xì)胞傳代前以及傳代后 0h，6h，12h，24h，48h的細(xì)胞生長狀況。從圖中可以看出細(xì)胞傳代后 0-12h 細(xì)胞的貼壁量較少，24h 時可達(dá)到 80%-90%的貼壁量，48h 時基本貼滿。

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉雙鳴;劉敏躍;李鵬;龍淼;張q

本文編號：2722190