【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的各種家畜及野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。該病自1947年傳入我國,通過疫苗免疫疫情基本呈穩(wěn)定狀態(tài)。2011年以后,以HeN1株為代表的變異株在全國多個(gè)地區(qū)爆發(fā)流行,原有疫苗不能對(duì)豬群提供完全保護(hù),這對(duì)偽狂犬病的監(jiān)控及病原結(jié)構(gòu)的研究提出了新的要求。豬偽狂犬病毒gB糖蛋白具有很好得保守性,通過檢測(cè)gB蛋白可以反映豬群的抗體水平。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖侵苽淇筆RV gB蛋白的單克隆抗體并鑒定其抗原表位。以超離純化的PRV HeN1株全病毒為抗原免疫6周齡BALB/c小鼠,取免疫后血清抗體呈陽性的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,用免疫熒光的方法(IFA)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)過4次亞克隆獲得一株穩(wěn)定分泌抗PRV gB蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1E7。Western blot結(jié)果表明,1E7細(xì)胞分泌的單克隆抗體與PRV全病毒和真核表達(dá)的gB蛋白均能反應(yīng)�？贵w亞類鑒定1E7細(xì)胞分泌的單抗重鏈屬于IgG2b亞類,輕鏈為kappa鏈。ELISA試驗(yàn)顯示1E7細(xì)胞分泌的單抗與PRV的結(jié)合可以被豬陽性血清阻斷。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和制備的腹水中抗體的IFA效價(jià)分別為1:160和1:12800。利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)一系列g(shù)B截短蛋白,最終確定1E7細(xì)胞分泌的單抗識(shí)別的抗原表位是S~(81)AEESLE~(87),且此表位在各PRV毒株間相對(duì)保守。本單克隆抗體的成功制備為PRV抗體檢測(cè)方法的建立及gB蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

犬病病毒 HeN1 株 gB 蛋白單克隆抗體制5-20 min，加入 2M H2SO4，50 μL/孔純化后的 PRV HeN1 蛋白濃度為 2 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)上清 100 倍稀釋后N1 gE單克隆抗體和兔抗鼠紅外熒光 PRV HeN1 為抗原的泳道，在 120V HeN1 病毒能被 PRV HeN1 病毒 M 1 2kDa

2.3.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選對(duì)上述血清抗體含量高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后取加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 以 PEG 為融合劑對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行融合，融合后 14 d 時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)滿底部的 1/4，以感染了 PRV HeN1 病毒的 Vero 細(xì)胞為抗原經(jīng) IFA 方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行第一次篩選，將篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞繼續(xù)用轉(zhuǎn)染了 PCDNA3.1(+) PRV HeN1 gB 質(zhì)粒的293T 細(xì)胞為抗原經(jīng) IFA 方法進(jìn)行第二次篩選，將兩次鑒定均為陽性的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法即亞克隆，經(jīng)過 4 次亞克隆，最終獲得一株穩(wěn)定分泌抗 PRV HeN1 gB 蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將其命名為 IE7，1E7 分泌的單克隆抗體可以特異性識(shí)別 PRV HeN1，PRV HeN1gB，如圖 2.3。圖 2.2 免疫后小鼠血清的 IFA 分析（200×）A-F：免疫后小鼠血清 G：未免疫小鼠血清Fig 2.2 IFAanalysis of mouse serum after immunization（200×）A-F: mouse serum after immunization G: mouse serum without immunization

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2720168