【摘要】：單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種胞內(nèi)致病菌,主要感染免疫功能低下的個體,可致敗血癥、腦膜炎、胎兒感染或流產(chǎn)等。寡肽轉(zhuǎn)運蛋白(Oligeopeptide transporter,Opp)是寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中運送胞內(nèi)生長所必需的氨基酸及調(diào)控細菌毒力的一類蛋白質(zhì)。在基于利用泛基因組技術(shù)對LM的研究中,首次發(fā)現(xiàn)lmo2193基因具有Opp活性,但其具體功能尚未知。本研究以新疆綿羊腦炎臨床分離株LM90SB2為研究材料,對lmo2193基因進行克隆、生物信息學分析及原核表達后通過重疊延伸PCR與同源重組技術(shù)構(gòu)建lmo2193基因缺失株及回補株,并將缺失株分別與野毒株、回補株進行比較,分析其環(huán)境適應性、生物被膜形成能力、細胞粘附侵襲性、胞內(nèi)增殖毒力影響等探究lmo2193基因作為Opp在LM中的功能及其對致病性的影響。目的:(1)生物信息學分析推測LM90SB2菌株lmo2193基因功能。(2)構(gòu)建該基因的缺失株及回補株。(3)研究該基因缺失對LM環(huán)境適應性及生物被膜形成能力的影響。(4)研究該基因缺失對LM毒力的影響。方法:(1)PCR擴增lmo2193基因,克隆測序,進行生物信息學分析,并表達該蛋白,用SDS-PAGE凝膠電泳與Western Blot技術(shù)鑒定。(2)PCR擴增上下游臂,利用重疊延伸PCR擴增融合片段,與穿梭質(zhì)粒pKSV7連接,電轉(zhuǎn)至野毒株感受態(tài)中篩選陽性轉(zhuǎn)化子,雙重壓力傳代培養(yǎng)篩選基因缺失株;將該基因與整合型質(zhì)粒pIMK2連接,電轉(zhuǎn)至缺失株感受態(tài)中篩選基因回補株;檢測遺傳穩(wěn)定性。(3)在不同環(huán)境壓力條件下對缺失株與野毒株、回補株的生長曲線及不同時間段生物被膜形成進行比較。(4)分別利用缺失株、野毒株、回補株感染不同來源的細胞,對細胞粘附、侵襲性及胞內(nèi)增殖能力進行比較;感染小鼠,檢測LD_(50)及比較肝臟、脾臟、腦組織載菌量的差異。結(jié)果:(1)生物信息學分析顯示:lmo2193蛋白為ATP超家族,推定該基因為oppD;原核表達該基因,獲得60 kDa左右的融合蛋白,與預期一致。(2)成功構(gòu)建了具有良好穩(wěn)定遺傳性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回補株CLM90SB2ΔoppD。(3)在不同溫度、EtOH濃度、pH、NaCl濃度條件下LM90SB2ΔoppD比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD生長緩慢;LM90SB2ΔoppD的網(wǎng)格密集程度與生物被膜形成量均低于LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD。(4)LM90SB2ΔoppD對四種細胞的粘附及侵襲率相比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD均有所下降;在SIEC細胞內(nèi),三株細菌增殖量均逐漸減少,而在RAW264.7、MBMEC和HBMEC,菌量均呈逐漸增多趨勢;小鼠實驗中,LM90SB2ΔoppD的毒力水平較LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD分別提高了1.34、0.5個數(shù)量級;LM90SB2ΔoppD在各組織載菌量均低于LM90SB2與CLM90SB2ΔoppD。結(jié)論:(1)推定LM90SB2菌株lmo2193基因功能為OppD。(2)成功構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回補株CLM90SB2ΔoppD。(3)LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失會使其環(huán)境適應性及生物被膜形成能力降低。(4)LM90SB2菌株lmo2193基因缺失會使其毒力下降。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61
【圖文】：

Opp基本結(jié)構(gòu)示意圖（A）及操縱子（B）示意圖（引自張偉欣）

1-1 lmo2193 基因 PCR 擴增結(jié)果CR amplification results of lmo2193 gene DNAMarKer；1：lmo2193 基因 PCR 擴果；2：hly 基因鑒定；3-4：空白000 DNAMarKer; 1: PCR products of3 gene; 2: Identification of hly gene; 3-4:圖 1-2 pMT19T-2193 重組質(zhì)粒Fig.1-2 Identification of recompMD19T-2193 by enzymM: 2 000 DNAMarKer；1：pM切產(chǎn)物； 2：pMD19M: 2 000 DNAMarKer; 1: pM

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何志剛;李傳富;;雙柄環(huán)結(jié)構(gòu)——人類基因缺失的熱點[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1989年01期

2 李鵬;張大可;周莉;董培玲;李秀惠;姚勤偉;王淑珍;丁惠國;曾長青;;慢性乙型肝炎病毒感染S區(qū)基因缺失及相關(guān)因素研究[J];臨床肝膽病雜志;2008年03期

3 汪惠園,夏瑞祥,汪淵,周波,周青,劉虎,焦增富,曾慶曙,任立奮,蔡學杰;急性淋巴細胞白血病p16/MTS1基因缺失與臨床預后相關(guān)性研究[J];中華血液學雜志;2000年02期

4 董洪燕;彭大新;焦新安;陳素娟;孫化露;王小波;劉秀梵;;五株基因缺失的腸炎沙門菌免疫原性的研究[J];中國獸醫(yī)科學;2014年01期

5 王繼旺,辛洪濤,侯林江,楊胥英,王磊;原發(fā)性非小細胞肺癌的P~(16)基因缺失及其臨床意義[J];山東醫(yī)藥;1999年20期

6 張洋溢;謝文浩;曹三杰;黃小波;文心田;冉曦;張飛;;三株胸膜肺炎放線桿菌基因缺失株免疫原性的研究[J];中國獸醫(yī)科學;2014年08期

7 ;研究顯示嚴重肥胖可能由成段基因缺失導致[J];中學生物教學;2010年03期

8 麻宏偉,王志超,王華,張海娟;Xp21鄰近基因缺失綜合征1例[J];中國實用兒科雜志;2002年03期

9 汪惠園,夏瑞祥,汪淵,焦增富,魯云霞,趙萍,周波,蔡學杰;p16/MTS1基因缺失在急性淋巴細胞白血病發(fā)病中的作用[J];安徽醫(yī)科大學學報;1999年06期

10 肖農(nóng),倪婧,汪淵,周青,曾慶曙,王永慶,夏瑞祥;急性粒細胞性白血病7q染色體雜合性缺失研究[J];疾病控制雜志;2004年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張玉霞;;APOBEC3B基因缺失在浙江人群中的分布[A];2009年浙江省檢驗醫(yī)學學術(shù)年會論文匯編[C];2009年

2 雷娟娟;王艷尊;黃建忠;;SNF1基因缺失釀酒酵母菌株的構(gòu)建[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

3 張春杰;陳松彪;程相朝;余祖華;何雷;郁川;廖成水;賈艷艷;;鼠傷寒沙門菌SL1344株cya基因缺失株減毒機制的初步研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十六次學術(shù)研討會論文集[C];2015年

4 陳松彪;張春杰;程相朝;廖成水;李靜;郁川;龍塔;;鼠傷寒沙門菌SL1344株crp基因缺失株生物學特性的測定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第二十一次學術(shù)研討會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會第二十次學術(shù)研討會論文集[C];2015年

5 周永安;席衛(wèi)平;武堅銳;李玉軍;夏麗;郭躍貞;周巖;孫夏瑜;;多重聚合酶鏈反應檢測DMD/BMD患者的基因缺失[A];第八次全國醫(yī)學遺傳學學術(shù)會議(中華醫(yī)學會2009年醫(yī)學遺傳學年會)論文摘要匯編[C];2009年

6 魯陽;林長坤;劉麗英;金春蓮;;應用多重PCR方法對東北地區(qū)dystrophin基因缺失分布的研究及其應用[A];中國優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會第三屆學術(shù)研討會專輯[C];2003年

7 江雅麗;王紅紅;陳創(chuàng)夫;王震;李爽;李志強;張輝;郭飛;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應蛋白BMEI1135基因缺失株的構(gòu)建及其功能的初步研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會、中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會、中國實驗動物學會實驗病理學專業(yè)委員會2016年學術(shù)研討會論文集[C];2016年

8 孫洋;劉軍;郭學軍;祝令偉;周博;尹鐵勇;馮書章;;腸出血性大腸桿菌O157:H7基因缺失弱毒疫苗株的研究[A];全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集[C];2006年

9 趙燁;陳少鵬;王軍;吳李君;;p21和hus1基因缺失對輻射引起的旁效應信號產(chǎn)生和傳導的研究[A];第十一次中國生物物理學術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

10 曾秀;郭萬柱;朱玲;徐志文;王印;梅淼;余慶;;ORF2基因缺失的PCV2的構(gòu)建與部分生物學特性研究[A];第五屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前7條

1 劉霞;基因缺失阻礙人長高[N];科技日報;2011年

2 實習生 程鳳;不愛鍛煉可能與基因缺失有關(guān)[N];科技日報;2011年

3 王銳;美研究發(fā)現(xiàn)心臟病與基因缺失有關(guān)[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2004年

4 孟慧娟 費智平;基因缺失可導致心臟病[N];解放日報;2000年

5 通訊員 孟慧娟 記者 葉又紅;先天性心臟病與基因缺失有關(guān)[N];文匯報;2000年

6 劉寧春 楊麗佳;先心病與部分基因缺失有關(guān)[N];健康報;2005年

7 ;偽狂犬病雙基因缺失活疫苗[N];河南科技報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 林荔雯;胸膜肺炎放線桿菌△apxIC/△apxIIC雙基因缺失株的構(gòu)建及其生物學特性和免疫原性的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2007年

2 司微;雞腸炎沙門氏菌SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB基因缺失株的構(gòu)建及其保護效力評價[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 崔紅晶;釀酒酵母PMT1基因缺失延長細胞復制壽命的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

4 郭廣君;豬偽狂犬病病毒野毒與基因缺失疫苗株鑒別檢測方法的建立及應用[D];吉林大學;2013年

5 張麗琳;釀酒酵母應對鎘脅迫的分子機理研究[D];天津大學;2012年

6 賈彩鳳;REGγ調(diào)控脂質(zhì)代謝的研究[D];華東師范大學;2014年

7 龐茂達;嗜水氣單胞菌流行株基因組特征及毒力相關(guān)基因研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2015年

8 趙經(jīng)文;釀酒酵母耐鋰鹽的分子機理研究[D];天津大學;2014年

9 王娜;嗜水氣單胞菌浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)比較蛋白質(zhì)組學及相關(guān)蛋白特性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

10 汪洋;豬鏈球菌生物被膜形成及致病機理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2011年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 李紅歡;單增李斯特菌lmo2193基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學特性研究[D];石河子大學;2019年

2 張峰;利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建MDV meq基因缺失株及其檢測方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2019年

3 張健;Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響[D];山東大學;2018年

4 楊楠;狐源致病性大腸桿菌HtrA蛋白的免疫保護力及功能研究[D];河北科技師范學院;2018年

5 尹華;單核細胞增生性李斯特菌llsB基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學特性的研究[D];石河子大學;2018年

6 田歌;GSTM1基因缺失對霧霾所致健康志愿者急性呼吸道炎性反應和肺功能改變的影響[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2018年

7 傅春玲;PTEN基因缺失對活性氧和輻射敏感性影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2007年

8 唐福余;馬鏈球菌獸疫亞種類M基因缺失株的構(gòu)建及生物特性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

9 隋珂;DDR2基因缺失對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性影響的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

10 趙貝貝;IKZF1基因缺失與兒童急性淋巴細胞性白血病臨床及預后關(guān)系的回顧性分析[D];蘇州大學;2014年

本文編號：2718986