【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone)是一種主要由鐮刀菌產(chǎn)生的具有假雌激素作用的霉菌毒素,會(huì)對(duì)動(dòng)物的生殖系統(tǒng)造成損傷,影響生育功能。玉米是重要的糧食及飼料來(lái)源,同時(shí)也是受到玉米赤霉烯酮污染的主要農(nóng)作物,近年來(lái)玉米赤霉烯酮的污染范圍和程度有擴(kuò)大上升趨勢(shì),因此如何降解受污染農(nóng)作物中玉米赤霉烯酮正成為亟需解決的安全和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)采用的生物方法是酶法降解,選用一種玉米赤霉烯酮內(nèi)酯水解酶,該酶能夠打開(kāi)玉米赤霉烯酮分子中的內(nèi)酯環(huán),使得開(kāi)環(huán)后的玉米赤霉烯酮不再能與雌激素受體結(jié)合,從而起到毒素降解的作用。本實(shí)驗(yàn)成功在畢赤酵母中表達(dá)了一段來(lái)源于粗糙脈孢菌的玉米赤霉烯酮內(nèi)酯水解酶基因,該基因全長(zhǎng)888 bp,表達(dá)產(chǎn)物含有296個(gè)氨基酸,具有三聯(lián)催化位點(diǎn),屬絲氨酸蛋白酶家族。通過(guò)電轉(zhuǎn)化成功將該基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母中,獲得重組畢赤酵母,并對(duì)該酶進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵和30L發(fā)酵罐發(fā)酵。甲醇誘導(dǎo)72 h后,重組畢赤酵母的搖瓶產(chǎn)量為40 U/ml;在搖瓶發(fā)酵之后還進(jìn)行了30L發(fā)酵罐發(fā)酵,在發(fā)酵90 h,亦即甲醇誘導(dǎo)72 h時(shí)發(fā)酵罐酶活達(dá)到最大,為290.6 U/ml,驗(yàn)證了該酶進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的可行性。將該酶純化后檢測(cè)了其酶學(xué)性質(zhì),該酶最適pH 8.0,最適溫度45℃,對(duì)玉米赤霉烯酮的K_m值為38.63±5.868μM,V_(max)為23.8μM/s/mg,對(duì)濃度為5 mM的Zn~(2+)、Mg~(2+)和Ca~(2+)等離子具有較好的耐受性,對(duì)EDTA和SDS、Mn~(2+)的耐受性較差。當(dāng)處于pH 6.0-8.0,37℃的環(huán)境條件時(shí),酶活可以穩(wěn)定存在1 h,24 h后酶活仍保持近一半。該酶在對(duì)10μg玉米赤霉烯酮純品進(jìn)行降解時(shí),反應(yīng)10 min可降解82%的玉米赤霉烯酮,反應(yīng)15min則可降解99%的玉米赤霉烯酮,液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)產(chǎn)物為無(wú)毒物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)還研究了該酶在常見(jiàn)飼料原料和發(fā)酵麩皮中的玉米赤霉烯酮降解效果。其在DDGS、玉米副產(chǎn)物及玉米皮中降解實(shí)驗(yàn)中的降解率分別可以達(dá)到70.9%、88.9%和94.7%;其在發(fā)酵麩皮中的降解率最高可達(dá)51%,且加入發(fā)酵菌粉比發(fā)酵菌液更有利于降解。此外還嘗試了對(duì)該酶應(yīng)用固定化技術(shù),提升了該酶對(duì)pH和溫度的耐受性并且可以多次循環(huán)使用。其中以活化CNBr瓊脂糖珠和活化NH_2瓊脂糖珠為載體的固定酶表現(xiàn)最佳,其在pH 5.0條件下相較于游離酶能夠保持更多的酶活,分別為52.5%和56.2%;在60?C條件下的酶活分別為50.9%和32.4%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該酶進(jìn)一步在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用有重要指導(dǎo)作用。
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q814;S859.8
【圖文】：

圖 1-1 玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Chemical structural formula of Zearalen來(lái)源及分布由鐮刀菌分泌產(chǎn)生，鐮刀菌是小麥赤霉病到土壤中霉菌沾染和作物收獲后在處理加受到玉米赤霉烯酮毒素的污染[23]。作物被便容易滋生霉菌，從而被霉菌毒素污染[24米則是最不易受霉菌毒素污染的作物[25]。類糧食作物均受到不同程度的玉米赤霉烯物中的玉米赤霉烯酮含量最高可達(dá) 1362μ均含量為 1700 μg/kg[27]；荷蘭的玉米作利的玉米中玉米赤霉烯酮含量少，均不超過(guò)物包括大麥小麥和玉米等，它們中的玉米為 647μg/kg[33]，其余作物含量不超過(guò) 100

ENC 總共 196 個(gè)密碼子根據(jù)畢赤酵母偏好性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，優(yōu)化量從 57.7 %降低至 44.81 %，密碼子適應(yīng)指數(shù)由 0.58 提升至 0.95。目的隆進(jìn) pPIC9K 質(zhì)粒，并進(jìn)行了酶切驗(yàn)證（圖 2.1.a 和圖 2.1.b）。使用 NCBINC 進(jìn)行氨基酸序列分析，推斷成熟的 ZENC 蛋白包含 296 個(gè)氨基酸殘基源于 N. tetrasperma 的推測(cè)蛋白具有 97 %的同源性，與經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證stachys rosea 的玉米赤霉烯酮水解酶（ZHD101）具有 29 %的同源性。對(duì)守結(jié)構(gòu)域同源性分析結(jié)果還表明， ZENC 與來(lái)源于 日本慢orhizobiumjaponicum）的 2-乙酰氨基亞甲基琥珀酸水解酶（2-acetamidate hydrolase，NCBI 檢索號(hào)：WP_010914326.1）具有 23 %的保守結(jié)構(gòu) 與來(lái)源于慢生根瘤菌的 2-乙酰氨基亞甲基琥珀酸水解酶都具有 α/β 水解有相同的三聯(lián)催化位點(diǎn)，該三聯(lián)催化位點(diǎn)是絲氨酸水解酶家族的主要特亞甲基琥珀酸水解酶的催化位點(diǎn)已經(jīng)被研究闡明，因此在保守域數(shù)據(jù)庫(kù)氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，ZENC 具有 Ser117、Asp141和 His274三聯(lián)斷 ZENC 屬于絲氨酸水解酶家族（圖 2.1.c）。

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本文編號(hào)：2715558