【摘要】：動物源性成分是一類來源于動物具有種屬代表性的物質(zhì),可以是核酸、蛋白,也可以是各種脂類和小分子物質(zhì)等。近年來,各種畜產(chǎn)品的摻假摻雜事件層出不窮,歐洲 馬肉風(fēng)波‖、中國 假羊肉事件‖等肉類摻假事件,飼料中非法添加反芻動物成分引起的瘋牛病全球性傳播等,這些畜產(chǎn)品安全問題嚴重影響肉類市場秩序和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。對食品和飼料中動物源性成分的定性、定量檢測是解決這一問題的重要技術(shù)手段。目前主要的檢測方法是基于線粒體DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在組織和個體間的拷貝數(shù)差異和堿基高變異性,使其易出現(xiàn)假陰性檢測結(jié)果,且難以實現(xiàn)準(zhǔn)確的定量,因而迫切需要篩選新的物種特異性的DNA序列。此外,肉類摻假檢測中多物種通用內(nèi)參的缺乏或保守性差等問題也影響畜產(chǎn)品定量檢測的準(zhǔn)確性。本研究利用動物全基因組序列和轉(zhuǎn)錄組信息,通過比較基因組學(xué)分析策略分別篩選物種特異性核DNA序列和多物種保守的核DNA序列,建立肉和飼料中多種動物源性成分的定性、定量檢測方法。為滿足畜產(chǎn)品安全監(jiān)管部門對動物源性成分鑒別的系統(tǒng)化、多元化、快速化的迫切需求提供技術(shù)支撐。取得的主要結(jié)果如下:1.物種特異性DNA序列的篩選及其分子特征分析為了獲得新的物種特異性DNA序列,本研究基于物種的全外顯子序列,以獨創(chuàng)的動態(tài)E-value結(jié)合Identity%、Quary-cover%為篩選條件,通過與Nt數(shù)據(jù)庫、非目標(biāo)物種基因組和目標(biāo)物種基因組的3次本地BLASTN序列比對分析,根據(jù)物種的分類地位,在11個科的19個物種中篩選各物種特異性外顯子。隨后,將各物種的特異性外顯子分為完全特異的外顯子序列(CESS)和部分特異的外顯子序列(PESS),并對其進行分布、結(jié)構(gòu)和序列特征的分析發(fā)現(xiàn):物種的特異性外顯子占物種總外顯子的比例很低,且與染色體的大小無關(guān)。其中的CESS主要分布在CDS區(qū),且序列內(nèi)部含有大量重復(fù)元件;長度較短的、高GC含量的外顯子更易發(fā)生片段的完全缺失或增加,且其形成與序列上下游的同向重復(fù)序列以及序列內(nèi)部的短重復(fù)序列有關(guān)。進一步利用各物種特異性DNA序列設(shè)計引物,并在19個物種中進行PCR檢測,驗證了序列和引物的物種特異性,實驗結(jié)果說明篩選的物種特異性DNA序列可作為種源成分檢測的靶標(biāo)。2.基于物種特異性DNA序列建立肉制品及動物源性飼料中種源成分的定性PCR檢測方法為了解決種源檢測中靶序列單一匱乏、特異性和保守性差等問題,基于篩選獲得的物種特異性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、豬、雞和鴨源性成分的定性PCR檢測方法。通過在線BLAST和ClustalW多序列比對分析,將物種特異性DNA序列分別與包含動物、植物和微生物在內(nèi)的4個界、11個綱、21個目、36個科、47個屬的53個代表性物種的參考基因組進行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)各序列均具有高度的種間特異性和種內(nèi)保守性。通過物種特異性引物設(shè)計并進行反應(yīng)體系、反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了5個物種5對引物相同反應(yīng)程序(退火溫度均為60℃)的PCR檢測方法,實現(xiàn)了肉中牛、羊、豬、雞、鴨成分的同時檢測。所建立的PCR檢測方法在19個物種中進行驗證,結(jié)果表明5個物種的種源檢測PCR方法具有高度的物種特異性,僅在目標(biāo)物種中具有擴增產(chǎn)物,其他物種中無任何產(chǎn)物;同時利用5個物種的44個個體進行PCR擴增都得到預(yù)期的擴增產(chǎn)物,通過對PCR產(chǎn)物進行測序,在同一物種中的序列具有一致性,說明這些物種特異性序列在物種內(nèi)具有高度的保守性。所建立的PCR檢測方法,靈敏度均可達到0.5ng。進一步對牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉的熟肉制品進行檢測,得到與產(chǎn)品種源成分一致的檢測結(jié)果,說明本方法可用于加工肉食中種源成分的檢測。針對瘋牛病的飼料源性傳播問題,篩選了�？铺禺愋曰騎AF4,該基因在牛和羊中存在18bp片段差異,針對該差異片段設(shè)計一對牛羊通用引物,但擴增產(chǎn)物大小不同,通過一次PCR反應(yīng)即可同時檢測和鑒別牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23個物種中表現(xiàn)出高度的物種特異性。對牛(黃牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(綿羊、山羊)不同品種進行PCR擴增和測序比對分析,結(jié)果表明該序列在牛、羊中都分別具有高度保守性。所建立的PCR檢測方法,靈敏度可達到0.2ng DNA。最后,對5份委托制作的動物源性飼料的檢測結(jié)果說明該方法具有檢測飼料樣品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的應(yīng)用價值。3.篩選哺乳動物和鳥類中高度保守的單拷貝序列作為多物種通用內(nèi)參并建立定量檢測方法定量檢測是對畜產(chǎn)品摻假情況進行準(zhǔn)確評估的一個重要方法。而可靠有效的定量內(nèi)參是解決這一問題的前提。本文從全基因組水平出發(fā),利用11個科的13個哺乳動物和鳥類物種的外顯子數(shù)據(jù),通過比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選了在哺乳動物和鳥類中同源率95%的高度保守的核DNA序列,并在保守區(qū)設(shè)計了多物種通用引物。通過在18個動物物種基因組中試驗驗證發(fā)現(xiàn),該序列具有高度保守性、且為單拷貝序列。基于多物種定量內(nèi)參,進一步建立和優(yōu)化了一種種源成分定量檢測方法,相對誤差(R.E.)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D.)均小于25%。并通過引入基因組當(dāng)量(GE)和校正系數(shù)k的概念,實現(xiàn)了DNA混合樣品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精準(zhǔn)的定量檢測。為畜產(chǎn)品中種源成分的準(zhǔn)確定量提供了可靠的多物種通用的定量內(nèi)參和檢測方法。4.基于多物種通用內(nèi)參建立肉制品中多種動物源性成分的多重定量檢測方法針對歐洲 馬肉風(fēng)波‖問題,結(jié)合牛、馬的特異性DNA序列和多物種通用內(nèi)參,建立了牛(223bp)、馬(197bp)和動物(129bp)源性成分的三重定性和定量檢測方法;針對我國 假羊肉事件‖,結(jié)合羊、狐、鼠的特異性DNA序列和多物種通用內(nèi)參,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量檢測方法。所有物種特異性序列均與包含動物、植物、微生物在內(nèi)的53個物種的參考基因組進行BLAST和ClustalW序列比對,并在堿基差異區(qū)設(shè)計物種特異性引物和探針。利用普通PCR和TaqMan熒光PCR在多個物種DNA中對序列、引物和探針的特異性進行驗證,并進而驗證了各物種特異性序列均為固定拷貝數(shù)的序列。多重PCR體系的建立說明各組引物和探針之間不存在交叉互作,確保了單一體系中多種種源成分的同時檢測和定量。保守性試驗表明各物種特異性序列和引物在各自目標(biāo)物種內(nèi)的高度保守性。靈敏度檢測結(jié)果表明檢出限(LOD)為0.05ng DNA,定量限(LOQ)達5%。并通過構(gòu)建各物種特異性序列和內(nèi)參序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立了GE與Ct值的計算關(guān)系,對多組DNA混合樣品和不同質(zhì)量比的混合肉樣品進行多重定量檢測,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量檢測方法的具有良好的檢測準(zhǔn)確度和精確度。本研究利用比較基因組學(xué)方法篩選物種特異性核DNA序列用于種源成分檢測;篩選保守性核DNA序列作為多物種定量內(nèi)參。進而建立了肉和飼料中牛、羊、豬、馬、雞、鴨、狐等多種種源成分的定性和定量檢測方法,為種源成分檢測提供了相應(yīng)的方法和候選素材,為食品和飼料安全提供重要的技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S816.17;TS251.1

【參考文獻】

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