發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 16:03

【摘要】：硫氧還蛋白(Trx)是一種廣泛存在于不同生物體內(nèi)的小分子蛋白,它在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化功能已被證明,我們課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),缺硒會(huì)引起雞心肌細(xì)胞發(fā)生損傷,又可以導(dǎo)致雞心肌細(xì)胞內(nèi)Trx的表達(dá)降低,因此我們猜測(cè)Trx與雞的心肌細(xì)胞損傷之間可能存在某種關(guān)系,但其具體的作用及機(jī)制尚不明確。因此,為了研究Trx在雞心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制,我們?cè)诮㈦u心肌細(xì)胞Trx基因敲低模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)、免疫印跡法、實(shí)時(shí)定量PCR等方法,對(duì)心肌細(xì)胞中硒蛋白、心肌細(xì)胞能量代謝水平、Akt磷酸化水平、熱休克蛋白(HSPs)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣離子水平及鈣離子通道、自噬和凋亡、炎癥、細(xì)胞因子等基因豐度及含量進(jìn)行檢測(cè),探討Trx在雞心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制,為更好更全面的了解Trx功能及作用提供重要證據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中能量代謝相關(guān)基因的變化,其中IGF1、IGF2、IGFBP2、IGFBP4、IR、IRS1、IRS2、GLUT1、GLUT3、GLUT8 mRNA水平和蛋白水平顯著降低,IGFBP3 mRNA和蛋白水平顯著升高,PI3K、AKT、P-PI3K mRNA水平和蛋白水平顯著降低,FOX、P-FOX、JNK mRNA水平和蛋白水平顯著升高,表明Trx基因敲低可以通過(guò)抑制PI3K/AKT通路引起心肌細(xì)胞中能量代謝的紊亂。(2)Trx基因敲低可以使心肌細(xì)胞中鈣離子含量發(fā)生顯著升高,引起雞心肌細(xì)胞中NCX、PMCA、CALM mRNA水平顯著降低,SERCA、STIM1、CACNA1S、TRPC1、TRPC3、Orail、TRP1、TRP2、TRP3、RyR1、RyR2、RyR3 mRNA水平顯著升高。同時(shí),SERCA的蛋白水平也發(fā)生了顯著升高,NCX、PMCA、CALM的蛋白發(fā)生了顯著降低。表明Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中鈣離子超載。(3)通過(guò)電子顯微鏡觀察,在Trx敲低組心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)明顯的自噬小體,提示Trx敲低可以引起雞心肌細(xì)胞發(fā)生自噬,從而造成心肌細(xì)胞發(fā)生損傷。同時(shí)我們通過(guò)檢測(cè)與自噬-凋亡相關(guān)基因的表達(dá)豐度時(shí)發(fā)現(xiàn),Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)基因mTOR mRNA水平顯著降低了,Becline-1、LC3-1、LC3-2、Dynein、SQSTM、ATG3、ATG5、ATG9、ATG12 mRNA水平則顯著升高,同時(shí),LC3-1、LC3-2、mTOR的蛋白水平也顯著降低,Becline-1蛋白水平顯著升高。表明Trx基因敲低使雞心肌細(xì)胞發(fā)生了明顯的自噬現(xiàn)象。Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、Fas mRNA水平顯著降低,Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9 mRNA水平顯著升高。同時(shí),Bax、Caspase-3的蛋白水平也發(fā)生了顯著降低,Bcl-2的蛋白水平顯著升高。表明Trx基因敲低啟動(dòng)了雞心肌細(xì)胞中凋亡通路,但是由于Caspase-3基因的抑制,我們認(rèn)為這種凋亡反應(yīng)不是引起心肌細(xì)胞損傷的主要原因,我們將其視為機(jī)體的一種前期保護(hù)機(jī)制。(4)Trx基因敲低可顯著引起雞心肌細(xì)胞中熱休克相關(guān)蛋白的變化,其中HSP40 mRNA水平顯著降低,HSP27、HSP60、HSP70以及HSP90 mRNA水平顯著升高。表明Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞發(fā)生熱休克反應(yīng),以此對(duì)抗不良條件下造成的細(xì)胞死亡。(5)Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的信號(hào)通路中XBP1、GRP78、GRP94、IRE、ATF4、ATF、EIF2αmRNA水平顯著升高,同時(shí),GRP78、XBP1、ATF4、ATF6的蛋白水平也顯著升高。表明Trx基因敲低可通過(guò)ATF6通路途徑引起雞心肌細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。(6)Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中與心肌細(xì)胞收縮功能相關(guān)的TNT,TNC mRNA和蛋白水平顯著降低,MYL2,MYL3 mRNA和蛋白水平顯著升高。表明Trx基因敲低使得雞心肌細(xì)胞收縮受到影響。(7)Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中炎癥和免疫相關(guān)基因的變化,其中IL-7,IL-17mRNA水平顯著降低,而iNOS、NF-κB、COX-2、TNF-α、PTGEs、HO-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 mRNA水平顯著升高,同時(shí),COX-2、HO-1、iNOS、NF-κB的蛋白水平也顯著升高。表明Trx基因敲低使雞心肌細(xì)胞發(fā)生了顯著的炎癥反應(yīng),而且某些相應(yīng)的細(xì)胞因子也發(fā)生變化,從而調(diào)控機(jī)體其他代謝反應(yīng)。(8)Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中25種不同硒蛋白的變化,其中Dio1、Dio2、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、TrxR1、TrxR2、TrxR3、Selt、Selw、Selk以及Sepx1水平顯著降低,而Dio3、Selm、Selp15、Selh、Selu、Seli、Seln、Sepp1、Selo、Sels、Sels2和Selp水平顯著升高,證實(shí)了Trx基因敲低可引起雞心肌細(xì)胞中硒蛋白表達(dá)含量的變化。綜上所述,Trx敲低可以通過(guò)抑制PI3K/AKT通路使雞心肌細(xì)胞胰島素代謝發(fā)生紊亂,能量代謝的紊亂進(jìn)一步可以誘發(fā)心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Ca~(2+)超載,繼而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,此外心肌細(xì)胞也發(fā)生了強(qiáng)烈的自噬反應(yīng)并伴有炎癥的發(fā)生,而在整個(gè)損傷過(guò)程中,熱休克蛋白發(fā)揮重要的保護(hù)功能。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.31
【圖文】：

3.7 雞心肌細(xì)胞中自噬-凋亡變化的檢測(cè)結(jié)果3.7.1 電子顯微鏡觀察雞心肌細(xì)胞自噬-凋亡的變化結(jié)果如圖3-13所示，利用電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在Trx敲低組心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)明顯的自噬小體，以及細(xì)胞核溶解等變化。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2713022