【摘要】：MiRNA是一類非編碼內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控小RNA,通過作用于靶基因的3′-UTR,抑制靶基因翻譯或者直接導(dǎo)致其降解,以達(dá)到對(duì)靶基因的調(diào)控目的。據(jù)統(tǒng)計(jì),miRNA能夠調(diào)控人基因組近1/3的蛋白編碼mRNA,因此,miRNA的挖掘、鑒定和功能驗(yàn)證是當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。體細(xì)胞克隆技術(shù)是指將動(dòng)物的的體細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞中,構(gòu)成重組胚,并最終發(fā)育成完整個(gè)體的技術(shù)。克隆牛的早期妊娠率較高,但隨著妊娠延續(xù)流產(chǎn)和異常妊娠(腹圍偏大)時(shí)有發(fā)生,致使克隆效率較低。本實(shí)驗(yàn)旨在利用高通量測序技術(shù),分析異常妊娠體細(xì)胞克隆牛和正常妊娠牛母體黃體組織中差異表達(dá)的miRNA,篩選并驗(yàn)證表達(dá)差異顯著的mi RNA,分析得到與妊娠維持相關(guān)的候選靶基因,并初步建立與妊娠維持相關(guān)的靶基因和miRNA相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而了解妊娠異常的分子調(diào)控機(jī)制。本研究采集2頭180d妊娠異常克隆牛為實(shí)驗(yàn)組,3頭180d正常妊娠牛為對(duì)照組,分別采集其黃體組織。利用Illumina測序平臺(tái),鑒定出2069個(gè)miRNAs,1759個(gè)miRNAs差異表達(dá),其中11個(gè)顯著上調(diào),22個(gè)顯著下調(diào)。利用SOAP靶基因分析軟件預(yù)測出5746個(gè)靶基因,得出miRNA靶基因富集顯著的KEGG通路和GO信號(hào)通路。分析發(fā)現(xiàn)hsa-mi R-874-5p、hsa-miR-152-5p、bta-miR-495、PC-5p-35049_13、PC-3p-41396_10與Bax,Caspase-9,TP53,AIF,Caspase-3,Cyto c,Apaf-1,ING2靶基因相互作用,通過調(diào)控黃體內(nèi)的細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致激素分泌水平異常,進(jìn)而影響母牛妊娠的維持。選取表達(dá)量較高的9個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNA,利用熒光定量PCR對(duì)其在體細(xì)胞克隆組與正常妊娠組中的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示6個(gè)與測序結(jié)果一致,3個(gè)測序不一致。選取細(xì)胞凋亡通路中的11個(gè)相關(guān)基因,利用熒光定量PCR檢測其表達(dá)量變化,初步確認(rèn)了黃體組織中細(xì)胞凋亡途徑在控制母牛妊娠時(shí)的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中存在著大量差異表達(dá)的miRNA,這些異常表達(dá)的miRNA與實(shí)驗(yàn)組妊娠異常有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)相關(guān)靶基因表達(dá)水平的鑒定發(fā)現(xiàn),一些miRNA對(duì)黃體中細(xì)胞凋亡通路有一定的調(diào)控作用,為后續(xù)miRNA的功能驗(yàn)證和黃體中參與妊娠維持的調(diào)控機(jī)制的探索奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S814.8
【圖文】：

圖 1 miRNA 的形成機(jī)制[57]Fig1.The formation mechanism of miRNA..3 miRNA 的作用機(jī)制miRNA 的形成及其對(duì)靶基因的作用機(jī)制是一個(gè)很誘雜的生理過程（圖 2）。起成熟的 miRNA 都是以雙反互補(bǔ)的形反存在，形成一種雙螺旋結(jié)構(gòu)。接下來，雙旋的螺旋打開，其中的一條會(huì)結(jié)誘到 RNA 細(xì)導(dǎo)的基因誘誘誘誘物中NA—induced silencing complex，RISC），進(jìn)而形成一種 RISC 誘誘物，該誘誘物和目標(biāo)基因相結(jié)誘。對(duì)動(dòng)物而言，研究發(fā)現(xiàn) miRNA 多與靶基因 3’UTR 發(fā)生不完對(duì)，從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的目的。對(duì)體物而言，miRNA 不僅能與靶基因TR 不完全配對(duì)，還能與靶基因的開開開開開開（ORF）完全配對(duì)，對(duì)相關(guān)靶基因剪切，從而使靶基因降解，以達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用[58]。

圖 2 miRNA 的作用途徑Fig 2 The role of miRNARNA 在動(dòng)物發(fā)育調(diào)控中的作用測，每一個(gè) miRNA 似乎都有可能調(diào)控著大量的靶基因[59-66]。因此種生物學(xué)功能，并調(diào)控著廣譜的蛋白編碼基因。這表明 miRNA了一種轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)控的基本模反，該模反可能存在于所有此，在黃體組織中同樣存在大量的可調(diào)控靶基因表達(dá)的 miRNAka 等報(bào)道 Dicer1d/d 小鼠黃體組織中血管的數(shù)目和長度顯p 和 let-7p 調(diào)節(jié)免血管生成因子 Timp1 的表達(dá)，維持黃體組織的血漿孕孕水平[67]。Hossain 等分析了 9 個(gè)已知和 38 個(gè)未知的牛源織和卵巢細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果表明成熟黃體高表達(dá)的 microRN達(dá)或低表達(dá)，證實(shí)了在牛的黃體中存在特異表達(dá)的 microRNA利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)檢測了 miR-147、miR-148b、miR-30 在牛功能黃體和退化黃體中的表達(dá)量變化[69]。徐靖博等利用實(shí)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 鄭華峰;陶晶;張斌;王純;吳淳;;MiR-495通過下調(diào)PCNA抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用研究[J];中國心血管病研究;2016年04期

2 黎佼;劉寧寧;胡明;曾波航;董s

本文編號(hào)：2712863