發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 01:21

【摘要】：公羊繁殖性能主要體現(xiàn)在配種能力和精液品質(zhì)兩個(gè)方面,精液品質(zhì)則與睪丸組織結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。睪丸發(fā)育和精子發(fā)生是影響公羊繁殖能力的重要因素。小尾寒羊是我國(guó)優(yōu)良的地方綿羊品種,以高繁殖力著名,是肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展中廣泛使用的母本品種,在我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究以小尾寒羊公羊?yàn)檠芯繉?duì)象:一、對(duì)小尾寒羊公羊進(jìn)行繁殖性能研究挑選出2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸,采用H.E.染色方法進(jìn)行組織學(xué)觀察。二、在2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸組織結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生進(jìn)程差異的基礎(chǔ)上,構(gòu)建睪丸mRNA文庫(kù)和sRNA文庫(kù),利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法對(duì)2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸中mRNA和miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析,并對(duì)miRNA與mRNA表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析,構(gòu)建miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選出睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的關(guān)鍵miRNA及其靶基因。三、利用qRT-PCR方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,并采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)篩選出的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生關(guān)鍵miRNA及其靶基因的靶向調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。旨在為揭示小尾寒羊公羊睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制及影響其優(yōu)秀繁殖性能的分子標(biāo)記提供理論依據(jù)。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:1.小尾寒羊公羊繁殖性能研究:結(jié)果表明,小尾寒羊公羊具有性早熟特性,公羔在75-88日齡出現(xiàn)性行為,6月齡可達(dá)性成熟。小尾寒羊睪丸發(fā)育與睪酮分泌水平呈正相關(guān),成年公羊射精量多,精液密度大,精子活率高,精子在體外存活時(shí)間長(zhǎng),精液品質(zhì)好,可用于常年配種。且2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸在曲細(xì)精管直徑和生精細(xì)胞數(shù)量等組織學(xué)上存在明顯差異,可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組差異分析。2.不同月齡小尾寒羊睪丸mRNA表達(dá)譜分析:成功構(gòu)建了2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸mRNA文庫(kù),2月齡vs 6月齡睪丸獲得630個(gè)差異基因(470個(gè)上調(diào)和160個(gè)下調(diào)),6月齡vs 12月齡睪丸獲得322個(gè)差異基因(218個(gè)上調(diào)和104個(gè)下調(diào)),2月齡vs 12月齡睪丸獲得102個(gè)差異基因(82個(gè)上調(diào)和20個(gè)下調(diào))。GO和pathway分析表明2月齡vs 6月齡睪丸的差異基因顯著富集到雄性求偶,類固醇代謝和精子發(fā)生等191個(gè)生物過(guò)程及氨基糖與核苷酸代謝,核苷酸切除修復(fù)及AMPK等17條信號(hào)通路。6月齡vs 12月齡睪丸的差異基因顯著富集到有性生殖,發(fā)育性細(xì)胞凋亡及精子獲能等311個(gè)生物過(guò)程及核糖體,多糖降解和核黃素代謝等8條信號(hào)通路。3組差異基因取并集后獲得的955個(gè)差異基因趨勢(shì)分析,共獲得8種表達(dá)譜并歸類為4種模式表達(dá)譜,根據(jù)4種模式表達(dá)譜構(gòu)建了4個(gè)基因間共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),篩選出29個(gè)睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的關(guān)鍵基因。隨機(jī)選取13個(gè)基因(CA3,APOH,MYOC,CATSPER4,SYT6,SERPINA10,DAZL,ADIPOR2,RAB13,CEP41,SPAG4,ODF1和FRG1)對(duì)mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果趨于一致,證明了mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。3.不同月齡小尾寒羊睪丸miRNA表達(dá)譜分析:成功構(gòu)建了2月齡,6月齡和12月齡小尾寒羊睪丸miRNA文庫(kù),2月齡vs 6月齡,6月齡vs 12月齡和2月齡vs12月齡睪丸中分別鑒定出差異表達(dá)綿羊已知miRNA:5個(gè),1個(gè)和4個(gè);差異表達(dá)novel miRNA:132個(gè),105個(gè)和24個(gè)。選取6個(gè)差異表達(dá)綿羊已知miRNA(oar-miR-379-5p,oar-miR-665-3p,oar-miR-200b,oar-miR-409-3p,oar-miR-495-3p和oar-miR-200c)和6個(gè)差異表達(dá)novel miRNA(has-miR-3592-5p,has-miR-6820-3p,has-miR-3615,mmu-miR-1957b,mmu-miR-182-3p和mmu-miR-1929-3p)對(duì)miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果趨于一致,證明了miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。4.差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè):結(jié)合miRNA與mRNA結(jié)果,對(duì)2月齡vs 6月齡,6月齡vs 12月齡和2月齡vs 12月齡睪丸差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),差異表達(dá)綿羊已知miRNA分別得到68個(gè),1個(gè)和9個(gè)靶基因,差異表達(dá)novel miRNA分別得到363個(gè),168個(gè)和29個(gè)靶基因。靶基因的GO和pathway分析表明,2月齡vs 6月齡睪丸差異表達(dá)綿羊已知miRNA的靶基因顯著富集到細(xì)胞凋亡,減數(shù)分裂I期,頂體反應(yīng)等100個(gè)生物過(guò)程及Hedgehog和Wnt等11條信號(hào)通路;6月齡vs 12月齡睪丸差異表達(dá)綿羊已知miRNA的靶基因顯著富集到多細(xì)胞生物生殖,精卵結(jié)合,單受精和蛋白水解4個(gè)生物過(guò)程;2月齡vs 12月齡睪丸差異表達(dá)綿羊已知miRNA的靶基因顯著富集到腺苷代謝,嘌呤堿基代謝及核苷酸代謝等17個(gè)生物過(guò)程及核黃素代謝和花生四烯酸代謝等4條信號(hào)通路。5.睪丸發(fā)育和精子發(fā)生關(guān)鍵miRNA及其靶基因篩選驗(yàn)證:構(gòu)建了3個(gè)miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),基于GO和KEGG分析,篩選出睪丸發(fā)育和精子發(fā)生關(guān)鍵oarmiR-379-5p及其候選靶基因WNT8A和oar-miR-665-3p及其候選靶基因CCIN。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果證明了WNT8A是oar-miR-379-5p的靶基因,CCIN可能不是oar-miR-665-3p的靶基因。 【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S826

【圖文】：

1.1 睪丸組織學(xué)結(jié)構(gòu)睪丸是雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中最重要的器官，存在于陰囊內(nèi)，呈橢圓形，左右各一，成對(duì)存在，分內(nèi)、外側(cè)面，前、后緣和上、下端。前緣游離，后緣有血管、神經(jīng)和淋巴管出入，并與附睪和輸精管的睪丸部相接觸。上端和后緣有附睪頭貼附，下端游離。睪丸表面覆有一層漿膜，漿膜下方是堅(jiān)硬致密結(jié)締組織構(gòu)成的白膜，漿膜和白膜構(gòu)成了睪丸的被膜（稱為固有鞘膜），白膜沿睪丸后緣增厚，深入睪丸內(nèi)形成睪丸縱隔，從縱隔發(fā)出許多呈放射狀排列的結(jié)締組織，將睪丸又分成許多小葉，睪丸小葉內(nèi)包含盤曲折疊的生精小管（曲細(xì)精管）[5]。睪丸主要分為兩部分：睪丸間質(zhì)和曲細(xì)精管。睪丸間質(zhì)由疏松結(jié)締組織、血管和淋巴管、以及多種類型細(xì)胞（包括間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、粒細(xì)胞）組成；曲細(xì)精管，每條長(zhǎng)約 30~80cm，直徑150~250μm，，主要由基膜，管周細(xì)胞，支持細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子）組成，是精子發(fā)生的場(chǎng)所[6]，睪丸內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。

圖 1.2 睪丸生精小管中精子發(fā)生的進(jìn)程Fig. 1.2 The process of spermatogenesis in testicular seminiferous tubules1.2 精子發(fā)生哺乳動(dòng)物精子發(fā)生是一個(gè)發(fā)生在曲細(xì)精管中由精原干細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂增值分化后再經(jīng)過(guò)一系列的分裂和分化形成精子的高度復(fù)雜而精密過(guò)程[20]。雄性哺乳動(dòng)物的睪丸曲細(xì)精管生精上皮上從青春期開(kāi)始直到睪丸生殖機(jī)能衰退一直進(jìn)行著生精細(xì)胞的增值分化并不斷產(chǎn)生成熟精子。精子發(fā)生過(guò)程包括染色體復(fù)制、基因重組、二倍體細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂（染色體數(shù)目減半）產(chǎn)生單倍體精子細(xì)胞以及球形精子細(xì)胞分化形成高度壓縮的蝌蚪狀精子釋放到管腔。簡(jiǎn)而言之，精子發(fā)生主要分為三個(gè)階段：(1) 精原細(xì)胞增值分化形成初級(jí)精母細(xì)胞——精原細(xì)胞有絲分裂增殖分化階段；（2）初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)歷兩次連續(xù)的減數(shù)分裂形成圓形精子細(xì)胞——精母細(xì)胞減數(shù)分裂階段；（3）圓形精子細(xì)胞分化變形為成熟精子釋放到管腔后轉(zhuǎn)移至附睪中成熟、儲(chǔ)存——精子形成階段。1.2.1 精原細(xì)胞有絲分裂增殖分化階段

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本文編號(hào)：2712045