發(fā)布時間：2020-06-13 06:48

【摘要】：禽白血病(Avian leukosis,AL)是一種由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的雞的以垂直傳播為主的腫瘤性傳染病,目前在世界上廣泛分布。隨著科學家不斷的研究和探索,目前已經發(fā)現A、B、C、D和J亞群5種外源性的白血病病毒,以及E、F、G、H和I亞群5種內源性病毒。在雞群中可分離到的ALV分別屬于A、B、C、D、E和J6個亞群,近年研究者認為我國雞群中存在K亞群ALV。總結以往的研究發(fā)現,A亞群、B亞群和J亞群是現場流行最廣的ALV亞群。本實驗室于2017年從疑似患有AL的河田雞中分離并鑒定了自然重組毒株ALV-FJ15HT0,該毒株具有ALV-B特異性gp85基因序列、ALV-Egp37序列和ALV-JLTR序列。為研究該毒株的分子特性及致病特性,本研究通過建立人工感染動物模型,模擬垂直傳播,并且通過轉錄組測序分析,進一步探究參與重組ALV與宿主細胞之間互作的基因,并且從蛋白質水平上加以分析驗證,為進一步研究自然重組ALV的致病機制等提供科學數據。1.感染組雞體重及免疫器官指數的變化在2d、5d、9d、13d、17d、21d時稱量空白對照組和垂直感染組雞體重,采集血液、肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺,并且稱量器官重量,計算免疫器官指數,使用qRT-PCR在不同時間點測量gp85在不同組織中的表達。結果顯示,感染組雞胚在孵化后生長受到顯著性抑制(P0.01),感染組法氏囊器官指數顯著受抑(P0.05),而感染組和對照組的脾臟,胸腺和肝臟器官指數在檢測的這6個時間點上沒有顯著差異(P0.05)。隨著日齡的增長,ALV病毒含量隨著日齡的增長而顯著增加;相關性分析顯示,包括法氏囊(r=-0.546),脾臟(r=-0.502)和肝臟(r=-0.517)在內的感染組織中gp85基因表達的變化與相應的體重差異之間呈現出顯著相關性(P0.05),感染組胸腺組織中gp85轉錄水平變化與相應的體重差異之間呈現出極顯著相關性(r=-0.559,P0.01)。2.自然重組ALV感染SPF雞胸腺轉錄組學分析本研究將ALV-FJ15HT0接種到6胚齡(ED)SPF雞胚的卵黃囊中模擬垂直傳播,同時設立空白對照組。分別于5日齡(d)、13d和21d時無菌采集空白對照組和感染組雞胸腺進行轉錄組測序。結果顯示,5d時在兩組動物胸腺樣品中檢測到227個差異表達基因(DEG)、13d檢測到286個DEG,21d檢測到251個DEG,這些DEG主要涉及細胞過程、結合、生物學調節(jié)、代謝加工、刺激反應和免疫系統(tǒng)等反應。通過信號通路富集分析發(fā)現,這些DEG主要涉及的信號通路有煙酸和煙酰胺代謝、細胞因子-細胞因子受體相互作用、脂肪酸降解、PPAR信號通路、細胞外基質受體相互作用、細胞粘附分子、JAK-STAT信號通路等。運用qRT-PCR技術對轉錄組測序得到的部分差異表達的基因進行驗證,結果顯示兩者的檢測結果相一致。3.睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF)及其受體(CNTFRα)參與病毒宿主互作通過信號通路分析,發(fā)現一個有趣的基因即CNTFRα在感染SPF白萊杭雞胸腺中表達顯著上調,經過對該基因的動態(tài)表達進行qRT-PCR檢測。結果顯示,在感染雞胸腺中CNTFRα基因表達在13-21d期間極顯著上調(P0.01),對感染雞和對照雞群血清CNTF滴度進行ELISA檢測發(fā)現感染雞血清CNTF在17-21d顯著上升(P0.05)。通過Pearson相關性分析發(fā)現:感染雞胸腺中CNTFRα基因表達水平與相應的gp85基因表達水平呈現極顯著正相關關系(r=0.656,P0.01),進一步驗證發(fā)現,感染雞肝臟中CNTFRα基因表達水平與相應的gp85基因表達水平呈現顯著正相關關系(r=0.525,P0.05),可知CNTF及CNTFRα可能參與重組ALV與宿主之間的互作。通過原核表達技術獲得雞CNTFRα蛋白并進行純化,濃度達到0.6 mg/mL。將純化后的蛋白在新西蘭白兔皮下進行5次多點注射免疫,使其產生抗體。使用Western Blot技術對兔血清抗雞CNTFRα抗體進行特異性檢測,結果顯示,抗體濃度在1:2 000時,抗體結合率最高且特異性強。以Western Blot鑒定空白對照組和垂直感染組動物胸腺CNTFRα蛋白。結果顯示,空白對照組和垂直感染組雞胸腺中CNTFRα蛋白表達水平均隨著日齡增加而降低,在13-21d時,垂直感染組雞胸腺中CNTFRα蛋白表達水平顯著高于空白對照組(P0.05),這一結果與CNTFRα轉錄水平結果相一致。進一步證實CNTFRα參與病毒與機體的互作。
【圖文】：

合［１５］，啟動ＡＬＶ的反轉錄過程。禽白血病病毒的非編碼區(qū)分布在兩端，形成長末逡逑端序列（Ｌｏｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅｐｅａｔｓ，邋ＬＴＲ）影響病毒ＲＮＡ的復制及翻譯；編碼區(qū)則由逡逑核心蛋白、酶蛋白、ＤＮＡ聚合酶和囊膜蛋白４個結構基因組成，見圖１－２［１６］。核心逡逑蛋白包含衣殼蛋白ｐ２７是群特異性抗原，是ＡＬＶ亞群分類的主要依據之一。病毒逡逑囊膜糖蛋白包括ｇｐ８５和ｇｐ３７兩種，外膜蛋白ｇｐ８５具有特異性識別功能，能夠識別逡逑靶細胞的特異性病毒受體，也具有亞群特異性，也是ＡＬＶ亞群分類的主要依據之逡逑一，ｇｐ３７為穿膜蛋白（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＴＭ），，負責病毒轉入細胞［１７］。病逡逑毒經反復凍融后會發(fā)生病毒粒子裂解同時釋放Ｐ２７群特異性抗原［１８］。逡逑５．１．？叫邐｜３觀逡逑Ｉ邐Ｉ！邐Ｈ—邋ｅ？ｖ邋—逡逑－ｓ－ｉｒｒＲ－４邐ｓ邋叩邐邐ｐ0ｉ邐Ｈ邐ｋｕＴＲ－ｊ逡逑ｌ｜ｌ邋Ｉ邋１｜邋Ｉ邋Ｉ邋ＩＩ＂１丨痛逡逑Ｕ３邋Ｒ邋Ｕ５邋Ｐｌ邋９ｐ２Ｐｌ邋0邋ＰＺ１邋ｐｌ邋２邋Ｐ１５邋ＲＴ邋ＩＮ邋８Ｐ８５邐ＤＲ１邋Ｕ３ＲＵＳ逡逑圖１－２邋ＡＬＶ的基因組結構圖［１６］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＬＶ逡逑１．３邋ＡＬＶ的分類逡逑隨著科學家不斷的研宄和探索，至今已經發(fā)現Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｊ亞群５種逡逑外源性禽白血病病毒，以及Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ和Ｉ亞群５種內源性禽白血病病毒。目逡逑２逡逑

（ｒ＝－０．５４６），脾臟（ｒ＝－０．５０２）和肝臟（ｒ＝－０．５１７）在內的感染組織中ｇｐ８５表達逡逑的變化與相應的體重差異顯著相關（戶＜0．0５）。胸腺中ｇｐ８５基因的動態(tài)表達如逡逑圖２－２ａ所示，感染組胸腺中ｇｐ８５的倍數變化與體重差異極顯著相關（ｒ＝－０．５５９，逡逑尸＜０．０１）（圖２－２ｂ）。據此，選擇胸腺作為用于轉錄組學檢測的組織。逡逑２４邋邐邋２０邋邐邐邐逡逑＜３）２0邋．邐□邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｇｒｏｕｐ邋１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋Ｇｒｏｕｐ邋ｊ邐＾邋１０邐0逡逑．２邋１５邐Ｔ邋ｉ邋‘W 邐Ｓ邐￣＾￣３＾０￣４００５００￣６００￣逡逑ｉ：：邋ｉ邋ｉ逡逑〗４」Ｊ」．［Ｌ丨：：９邐＾、逡逑＾邋Ｉ邋ｒｎ曑ｉ門＿邋ｉ門■邋ｉ門圈ｉ門Wｉ邋ｎ＿邐ｒ逡逑、邐２ｄ邋５ｄ邋９ｄ邋１３ｄ邋１７ｄ邋２１ｄ邋ｅ邋
【學位授予單位】：福建農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

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本文編號：2710815