【摘要】：H5亞型高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種重要疫病,同時,給社會公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。目前,我國流行H5亞型HPAIV主要是2.3.4.4分支。利用SPF雞胚生產(chǎn)H5亞型HPAI疫苗存在操作環(huán)境條件要求高、雞胚來源受限、生物安全性相對較差等缺點(diǎn)。本研究利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),成功構(gòu)建了2.3.4.4分支HPAI病毒樣顆粒(Virus-Like Particle,VLP),并研究其免疫原性,旨在為病毒樣顆粒疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。1.構(gòu)建THX4#-HA、THX4#-NA、THX4#-M1重組桿狀病毒載體質(zhì)粒。采用RT-PCR方法擴(kuò)增2.3.4.4分支HPAIV HA、NA和M1 3個基因片段,分別克隆至pFastBac1載體,通過雙酶切、測序鑒定,成功獲得pFastBac1-THX4#-HA、pFastBac1-THX4#-NA、pFastBac1-THX4#-M1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至DH10Bac細(xì)胞轉(zhuǎn)座形成重組桿狀病毒載體質(zhì)粒。2.VLP包裝和鑒定。將上述重組桿狀病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細(xì)胞,采用血凝(HA)試驗(yàn)、SDS-PAGE、Western Blot、透射電鏡觀察等方法鑒定VLP表達(dá)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后5 d,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變形、融合、囊泡化等特征性病變;病毒擴(kuò)增至第3代,細(xì)胞上清血凝HA效價達(dá)到6Log2;HA、NA、M1 3個目的基因成功表達(dá);電鏡下觀察到直徑80~120 nm有囊膜的禽流感VLPs。3.VLP免疫原性研究。SPF雞二免后15 d,利用ELISA方法檢測其血清IgG1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量,同時采用HI試驗(yàn)、中和試驗(yàn)檢測血清抗體水平。結(jié)果表明,血清H5亞型禽流感病毒HI抗體效價最高達(dá)到10Log2;VLP免疫血清對相同分支毒株中和抗體滴度為2~(-7.15),對其它分支毒株中和抗體滴度為2~(-6.85)。VLP疫苗免疫組血清IL-4、IFN-γ、IL-10含量顯著高于陰性對照組(P0.05),IgG1、IL-2含量均高于陰性對照組。綜上所述,本研究成功構(gòu)建由2.3.4.4分支H5亞型HPAIV HA、NA和M1蛋白組裝的VLP,其具有良好的免疫原性。本研究將為2.3.4.4分支H5亞型禽流感新型候選疫苗研發(fā)及該病的有效防控奠定堅實(shí)基礎(chǔ),為保證養(yǎng)禽安全生產(chǎn)提供了條件。
【圖文】：

圖 2-1 THX4#-HA，THX4#-NA，THX4#-M1 RT-P2-1 RT-PCR amplification of THX4#-HA, THX4#-NAHA 基因擴(kuò)增片段；2：NA 基因擴(kuò)增片段；3：M1M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)fragment; 2: NAgene fragment; 3: M1 gene fragment;質(zhì)粒鑒定斑篩選原理獲得陽性菌落，以 AMP+抗性 LT4-HA、T4-NA、T4-M1；以重組質(zhì)粒 T4-HA引物 HA-BamHⅠ-F&HA-EcoRⅠ-R、NA-X-F&M1-EcoRⅠ-R 分別擴(kuò)增 HA、NA、M1 基條帶大小分別約為 1.7 kb、1.4 kb、760 bp，基因片段。如圖 2-2 所示。重組質(zhì)粒測序結(jié)1 2 3 M（b

增片段；2：T4-HA 基因擴(kuò)增片段；3：T4-M1 基因擴(kuò)M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。ne fragment; 2: T4- HA gene fragment; 3: T4-M1 gene fragM: DNA Marker DL2000.酶切結(jié)果T4-HA、T4-NA、T4-M1 是否構(gòu)建成功的重要檢切。pGEM-Teasy 載體連接酶常用于催化雙鏈 D的連接反應(yīng)，也能催化雙鏈 RNA 5'-磷酸末端和功會出現(xiàn)載體條帶和目的條帶，因質(zhì)粒酶切不下需要加適量的限制性內(nèi)切酶和模板。本試驗(yàn)經(jīng)結(jié)果，如圖 2-3，pGEM-Teasy 載體大小約為 300為 1.7 kb、1.4 kb、760 bp，，與預(yù)期的結(jié)果一致，M1 M2 M31 2 30
【學(xué)位授予單位】：河北工程大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張樹梅;黃海碧;顏丕熙;滕巧泱;閆麗萍;徐大偉;呼和巴特爾;李澤君;;影響A型流感病毒樣顆粒包裝及釋放的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年13期

2 Yoko M,石偉光;Ⅰ型人類免疫缺陷病毒Gag病毒樣顆粒的體外組裝[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;2001年01期

3 李曉眠;任中原;訾自強(qiáng);周虹;;小圓形病毒樣因子引起新生兒急性胃腸炎的研究[J];病毒學(xué)雜志;1989年03期

4 李天芝;于新友;;雞病毒病病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展[J];養(yǎng)禽與禽病防治;2017年08期

5 吳憶春;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒疫苗研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2018年09期

6 許丹;鄭瑾;孫麗娜;耿宜萍;李旭;王一理;;HIV-1病毒樣顆粒真核表達(dá)系統(tǒng)的建立[J];西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年01期

7 沈明山,蘇文金,羅文新;存在于牡蠣肝胰腺的病毒樣顆粒的發(fā)現(xiàn)[J];廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年04期

8 譚波;袁芳;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒的構(gòu)建[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2016年06期

9 司菡;曲新勇;陸家海;;病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2008年01期

10 王亞君;華育平;;病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2008年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳霄;周子華;廖玉華;王敏;;乙肝核心病毒樣顆粒的克隆、改建、表達(dá)和純化[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

2 高曉藝;王傳彬;石玉祥;劉玉良;;H5N1亞型禽流感病毒樣顆粒構(gòu)建及其免疫原性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2018年學(xué)術(shù)年會禽病學(xué)分會第十九次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2018年

3 朱平;;病毒樣顆粒技術(shù)及其在冷凍電鏡研究中的應(yīng)用[A];第四屆全國冷凍電子顯微學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)專題研討會論文集[C];2015年

4 華榮虹;李業(yè)南;陳振師;劉立科;霍紅;王曉磊;郭立平;步志高;;流行性乙型腦炎病毒病毒樣顆粒的表達(dá)及免疫原性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2014年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2014年

5 李春燕;呂鳳林;趙揚(yáng)揚(yáng);陳千林;曹政;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒疫苗生產(chǎn)工藝研究[A];第五屆全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2017年

6 吳暄;楊鑫;曾凡亞;左磊;韓瀟瀟;徐鵬衛(wèi);王紅寧;;IBV N-M-E病毒樣顆粒的構(gòu)建及其免疫原性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第九次全國會員代表大會暨第十七次全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2017年

7 王賓;金華利;;融合性病毒樣顆粒口蹄疫DNA疫苗增強(qiáng)免疫效果的研究[A];中國生物工程學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨全國生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2006年

8 李芹;丁壯;;病毒樣顆粒研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2015年

9 王賓;金華利;;融合性病毒樣顆�？谔阋逥NA疫苗增強(qiáng)免疫效果的研究[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

10 魏葆s

本文編號：2710602