【摘要】：附紅細胞體病(Eperythrozoonosis,EHS)是由寄生在多種哺乳動物血液紅細胞表面無細胞壁結(jié)構(gòu)的生物—附紅細胞體(Eperythrozoon)引起的一種重要的人畜共患病。豬附紅細胞體病在豬群中普遍存在,臨床表現(xiàn)為發(fā)燒,皮膚出現(xiàn)發(fā)紺,出血點,黃疸和瘀斑等癥狀。附紅細胞體能導致機體免疫力下降,母豬繁殖障礙,嚴重的可引起死亡。由于豬附紅細胞體一直缺乏規(guī)范有效的診斷方法和處于隱性感染狀態(tài)易被忽視,因此建立準確有效的PCR診斷方法,在此基礎(chǔ)上研制豬附紅細胞體PCR診斷試劑盒是對豬附紅細胞體病診斷與防控是十分有必要的。本研究將從以下三個方面進行。根據(jù)已經(jīng)報道的豬附紅細胞體MSG1基因序列在其保守域內(nèi)設(shè)計了一對特異性引物,進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。PCR最適合的退火溫度為55℃,膠回收產(chǎn)物測序,測序結(jié)果與預(yù)估結(jié)果一致大小為1011bp,與Gen Bank上所公布的附紅細胞體MSG1基因(登錄號AM407404.1)序列同源性一致。本試驗建立的PCR診斷方法的特異性強,與健康豬的血液、弓形蟲、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬偽狂犬、豬瘟、豬圓環(huán)Ⅱ均無交叉反應(yīng)。陽性豬血樣檢測最低DNA濃度為20.0 fg/ul。該PCR診斷方法具有操作簡單、準確性高、靈敏度高等特點。為豬附紅細胞體病診斷以及試劑盒的組裝和感染情況調(diào)查提供了有力的手段。根據(jù)本研究建立的PCR診斷方法,通過構(gòu)建陽性對照、陰性對照,配制PCR引物和PCR反應(yīng)液,組裝了豬附紅細胞體病PCR診斷試劑盒。對試劑盒進行了特異性、靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及保質(zhì)期試驗。并利用組裝的檢測試劑盒,對臨床陽性樣本進行了檢測,以確定其準確性。與健康豬血樣,弓形蟲,豬細小病毒,豬偽狂犬,豬流行性腹瀉,豬乙型腦炎,豬圓環(huán)Ⅱ型病毒的基因組均無交叉反應(yīng),試劑盒最低檢測濃度為32.5fg/ul,重復(fù)性良好,經(jīng)過40次反復(fù)凍融試劑盒陽性對照擴增結(jié)果仍有條帶,-20℃條件下試劑盒保質(zhì)期為6個月。利用試劑盒對湖南省部分地區(qū)送檢的337頭份豬血液樣本進行附紅細胞體感染率檢測以及對其中100份育肥豬血液樣進行豬瘟、藍耳、豬偽狂犬病毒進行檢測。對湖南省內(nèi)湘潭、益陽、衡陽、永州、郴州五個地區(qū)豬附紅細胞體感染情況調(diào)查結(jié)果顯示,郴州地區(qū)豬附紅細胞體感染率最高為69.2%,永州豬附紅細胞體感染率為61.5%,衡陽地區(qū)豬附紅細胞體感染率58.4%,湘潭地區(qū)豬附紅細胞體感染率為58.4%,益陽感染率最低為55.3%。對不同種群感染情況調(diào)查可知種公豬的感染率為82.1%,母豬感染率為74.1%,育肥豬感染率為43.8%,仔豬感染率為26.6%�；旌细腥厩闆r調(diào)查:單獨感染率為4.6%,其中與豬瘟混合感染率為83.7%,與藍耳混合感染率為88.3%,與豬偽狂犬混合感染率為51.1%,四種疾病混合感染率為41.8%。結(jié)論:本研究建立了準確的診斷方法,組裝了豬附紅細胞體診斷試劑盒,對臨床感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)豬附紅細胞體病感染情況普遍存在,以混合感染形式為主,公豬感染率大于母豬與育肥豬,育肥豬感染率大于仔豬。
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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本文編號：2706462