【摘要】：布魯氏菌感染引起的布魯氏菌病是嚴重危害我國奶業(yè)發(fā)展的人獸共患病,由于缺乏安全可靠的疫苗和鑒別診斷手段,一直備受人們關注。深入揭示布魯氏菌的致病機制,是研發(fā)新疫苗和有效防控手段的關鍵,也是該病目前研究的熱點。布魯氏菌以肺泡巨噬細胞為靶細胞,在其中復制并干擾巨噬細胞的功能。布魯氏菌有多種免疫逃避機制,干擾模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)的識別是其隱秘進入宿主細胞及抑制固有免疫反應的關鍵。BtpB是依賴布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的一種效應分子,也是目前已知的主要毒力因子之一。NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)作為一種胞內(nèi)模式識別受體,在病原體入侵的固有免疫反應中發(fā)揮重要作用,由其裝配形成的NLRP3炎性體是一種存在于胞漿中的大分子多蛋白復合物,能夠感知病原微生物感染、組織損傷和代謝失衡時所釋放的分子信號。NLRP3激活后促進IL-1β等炎性因子的成熟和釋放,促進多種免疫相關基因的表達,并募集淋巴細胞至感染部位,從而抑制病原微生物感染。研究表明,布魯氏菌感染期間,其Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應分子BtpB能以多種方式干擾宿主的天然免疫應答,其中干擾TLRs信號傳導,進而抑制下游免疫級聯(lián)反應是主要方式之一。模式識別受體感受病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)后會引發(fā)NLRP3炎性體的激活,然而BtpB作為布魯氏菌的TIR結(jié)構(gòu)域蛋白與NLRP3炎性體之間的關系仍不清楚,其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的機制也有待進一步研究。為揭示IV型分泌系統(tǒng)效應分子BtpB與布魯氏菌生長表型及其與NLRP3炎性體活化的關系。本研究通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌S2株(B.suis S2)BtpB缺失株及其互補株;經(jīng)掃描電鏡觀察B.suis S2、BtpB缺失株和互補株的菌體形態(tài),測定生長曲線,及其在酸、熱、高滲、氧壓力等應激條件下生存率等差別,檢測BtpB對布魯氏菌生長特性的影響;通過細胞試驗,利用qRT-PCR、Western blot和細胞免疫熒光等相關技術(shù)檢測BtpB對B.suis S2侵染山羊肺泡巨噬細胞后模式識別受體、NLRP3炎性體組分以及相關炎性因子表達的影響。試驗結(jié)果如下:1.分別以復蘇的B.suis S2和pBBR1MCS5為模板,PCR擴增BtpB上下游同源臂和慶大霉素基因,將三段擴增產(chǎn)物連接到pUC19載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19G-BtpB。酶切、測序鑒定正確后,電擊轉(zhuǎn)入B.suis S2感受態(tài)細胞。經(jīng)慶大霉素抗性篩選、PCR鑒定獲得BtpB缺失株。PCR擴增BtpB基因,將其連接到表達載體pBB-PZT1上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBB-PZT1-BtpB。測序正確后,將其電擊轉(zhuǎn)入BtpB缺失株感受態(tài)細胞中,利用羧芐抗性篩選陽性克隆,經(jīng)Western blot鑒定正確后獲得BtpB互補株。2.掃描電鏡觀察B.suis S2、BtpB缺失株和互補株的形態(tài),發(fā)現(xiàn)BtpB對布魯氏菌形態(tài)無顯著影響。通過檢測B.suis S2、BtpB缺失株和互補株的生長曲線及其在山羊肺泡巨噬細胞內(nèi)的增殖,發(fā)現(xiàn)三株菌的胞外及胞內(nèi)增殖曲線均無顯著差異。測定在酸、熱、高滲、氧壓力等應激條件下三個菌株的生存率,發(fā)現(xiàn)與原始菌株和BtpB基因互補株相比,缺失株在氧化應激條件下生存率增加。3.通過qRT-PCR、免疫熒光、Western blot和ELISA檢測發(fā)現(xiàn):BtpB缺失株處理組,GAMs細胞TLR2、TLR4表達量上調(diào),與B.suis S2處理組和互補株處理組相比,差異顯著;BtpB缺失株處理組NLRP3炎性體相關組分NLRP3、ASC和caspase-1表達量顯著升高;同時,NLRP3炎性體下游細胞因子IL-1β表達量顯著增加,差異極顯著。以上結(jié)果表明,BtpB對布魯氏菌S2株生長特性無顯著影響,在布魯氏菌抑制宿主固有免疫的過程中可能通過NLRP3炎性體途徑發(fā)揮作用。
【圖文】：

第一章 布魯氏菌分泌系統(tǒng)與 NLRP3 炎性體研究進展魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)desan 等人（2016）利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫對 39 個完整的布魯氏菌基因組序列進析，，如圖 1-1 所示，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌中存在三種分泌系統(tǒng)，T1SS、T4SS、T5SS。蛋白質(zhì)直接從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞外環(huán)境。主要參與 RTX（repeats-in-toxin）蛋蛋白酶、細胞表層蛋白、脂肪酶等細胞毒素的分泌，也參與非蛋白底物，如葡聚糖和多糖的分泌。布魯氏菌中 ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可能是最常見及最廣泛的主統(tǒng)。T4SS 由一個多蛋白復合物組成，該復合物直接將蛋白質(zhì)分泌到宿主細泌的蛋白質(zhì)被稱為 IV 型分泌效應分子（type Ⅳ secretion effectors，T4SEs），氏菌的存活及其在受感染宿主細胞中的復制都是必不可少。T5SS 使用 S徑將未折疊蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到周質(zhì)，然后通過外膜復合物向細胞外分arasubramanianet al. 2016）。在這三種分泌系統(tǒng)中，由于 T4SS 對布魯氏菌的活和調(diào)節(jié)宿主的免疫反應起重要作用，因此得到了廣泛研究。

l et al. 2008）和腸道沙門氏菌的 TlpA（Newmanet al. 2006），布魯氏菌 TI白包括 BtpA/TcpB 和 BtpB（Salcedo et al. 2013；Salcedo et al. 2008）。BtpA abortus 2308，B.abortus 9-941 和 B. melitensis 16 M 中，但不存在于 B. su suis S2 中，而 BtpB 存在于所有已測序的布魯氏菌菌株中。近年來研究發(fā)現(xiàn)pB 作為布魯氏菌重要的毒力因子，在逃避宿主免疫應答的過程中發(fā)揮重要.2 BtpB 的結(jié)構(gòu)特點BtpB 是依賴布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的效應分子，與真核細胞 TIR 結(jié)構(gòu)源性（Newman et al. 2006）。探索 BtpB 結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在 N 末端含有螺旋束參與同源二聚化，為特異性的磷脂酰肌醇磷酸酯的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；在 C 末端域（aa 144-256），屬于細菌 TLRs 的 Pfam家族中的 TIR-2。TIR 結(jié)構(gòu)域由中行 β-折疊（βA-βE），四周由五個螺旋（αA-αE）和連接環(huán)包圍。BB 環(huán)連接旋 αB，在介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異性中起重要作用（Spear et al. 2分 DD 環(huán)和 EE 環(huán)殘基側(cè)鏈隱藏在二聚體的結(jié)構(gòu)內(nèi)部。A
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4

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本文編號：2704941