【摘要】：布魯氏菌感染引起的布魯氏菌病是嚴(yán)重危害我國(guó)奶業(yè)發(fā)展的人獸共患病,由于缺乏安全可靠的疫苗和鑒別診斷手段,一直備受人們關(guān)注。深入揭示布魯氏菌的致病機(jī)制,是研發(fā)新疫苗和有效防控手段的關(guān)鍵,也是該病目前研究的熱點(diǎn)。布魯氏菌以肺泡巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞,在其中復(fù)制并干擾巨噬細(xì)胞的功能。布魯氏菌有多種免疫逃避機(jī)制,干擾模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)的識(shí)別是其隱秘進(jìn)入宿主細(xì)胞及抑制固有免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。BtpB是依賴布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的一種效應(yīng)分子,也是目前已知的主要毒力因子之一。NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)作為一種胞內(nèi)模式識(shí)別受體,在病原體入侵的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,由其裝配形成的NLRP3炎性體是一種存在于胞漿中的大分子多蛋白復(fù)合物,能夠感知病原微生物感染、組織損傷和代謝失衡時(shí)所釋放的分子信號(hào)。NLRP3激活后促進(jìn)IL-1β等炎性因子的成熟和釋放,促進(jìn)多種免疫相關(guān)基因的表達(dá),并募集淋巴細(xì)胞至感染部位,從而抑制病原微生物感染。研究表明,布魯氏菌感染期間,其Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子BtpB能以多種方式干擾宿主的天然免疫應(yīng)答,其中干擾TLRs信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而抑制下游免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)是主要方式之一。模式識(shí)別受體感受病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)后會(huì)引發(fā)NLRP3炎性體的激活,然而BtpB作為布魯氏菌的TIR結(jié)構(gòu)域蛋白與NLRP3炎性體之間的關(guān)系仍不清楚,其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。為揭示IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子BtpB與布魯氏菌生長(zhǎng)表型及其與NLRP3炎性體活化的關(guān)系。本研究通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌S2株(B.suis S2)BtpB缺失株及其互補(bǔ)株;經(jīng)掃描電鏡觀察B.suis S2、BtpB缺失株和互補(bǔ)株的菌體形態(tài),測(cè)定生長(zhǎng)曲線,及其在酸、熱、高滲、氧壓力等應(yīng)激條件下生存率等差別,檢測(cè)BtpB對(duì)布魯氏菌生長(zhǎng)特性的影響;通過細(xì)胞試驗(yàn),利用qRT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光等相關(guān)技術(shù)檢測(cè)BtpB對(duì)B.suis S2侵染山羊肺泡巨噬細(xì)胞后模式識(shí)別受體、NLRP3炎性體組分以及相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.分別以復(fù)蘇的B.suis S2和pBBR1MCS5為模板,PCR擴(kuò)增BtpB上下游同源臂和慶大霉素基因,將三段擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pUC19載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19G-BtpB。酶切、測(cè)序鑒定正確后,電擊轉(zhuǎn)入B.suis S2感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)慶大霉素抗性篩選、PCR鑒定獲得BtpB缺失株。PCR擴(kuò)增BtpB基因,將其連接到表達(dá)載體pBB-PZT1上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBB-PZT1-BtpB。測(cè)序正確后,將其電擊轉(zhuǎn)入BtpB缺失株感受態(tài)細(xì)胞中,利用羧芐抗性篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)Western blot鑒定正確后獲得BtpB互補(bǔ)株。2.掃描電鏡觀察B.suis S2、BtpB缺失株和互補(bǔ)株的形態(tài),發(fā)現(xiàn)BtpB對(duì)布魯氏菌形態(tài)無(wú)顯著影響。通過檢測(cè)B.suis S2、BtpB缺失株和互補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線及其在山羊肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖,發(fā)現(xiàn)三株菌的胞外及胞內(nèi)增殖曲線均無(wú)顯著差異。測(cè)定在酸、熱、高滲、氧壓力等應(yīng)激條件下三個(gè)菌株的生存率,發(fā)現(xiàn)與原始菌株和BtpB基因互補(bǔ)株相比,缺失株在氧化應(yīng)激條件下生存率增加。3.通過qRT-PCR、免疫熒光、Western blot和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn):BtpB缺失株處理組,GAMs細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)量上調(diào),與B.suis S2處理組和互補(bǔ)株處理組相比,差異顯著;BtpB缺失株處理組NLRP3炎性體相關(guān)組分NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)量顯著升高;同時(shí),NLRP3炎性體下游細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)量顯著增加,差異極顯著。以上結(jié)果表明,BtpB對(duì)布魯氏菌S2株生長(zhǎng)特性無(wú)顯著影響,在布魯氏菌抑制宿主固有免疫的過程中可能通過NLRP3炎性體途徑發(fā)揮作用。
【圖文】：

第一章 布魯氏菌分泌系統(tǒng)與 NLRP3 炎性體研究進(jìn)展魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)desan 等人（2016）利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) 39 個(gè)完整的布魯氏菌基因組序列進(jìn)析，，如圖 1-1 所示，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌中存在三種分泌系統(tǒng)，T1SS、T4SS、T5SS。蛋白質(zhì)直接從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外環(huán)境。主要參與 RTX（repeats-in-toxin）蛋蛋白酶、細(xì)胞表層蛋白、脂肪酶等細(xì)胞毒素的分泌，也參與非蛋白底物，如葡聚糖和多糖的分泌。布魯氏菌中 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能是最常見及最廣泛的主統(tǒng)。T4SS 由一個(gè)多蛋白復(fù)合物組成，該復(fù)合物直接將蛋白質(zhì)分泌到宿主細(xì)泌的蛋白質(zhì)被稱為 IV 型分泌效應(yīng)分子（type Ⅳ secretion effectors，T4SEs），氏菌的存活及其在受感染宿主細(xì)胞中的復(fù)制都是必不可少。T5SS 使用 S徑將未折疊蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到周質(zhì)，然后通過外膜復(fù)合物向細(xì)胞外分arasubramanianet al. 2016）。在這三種分泌系統(tǒng)中，由于 T4SS 對(duì)布魯氏菌的活和調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)起重要作用，因此得到了廣泛研究。

l et al. 2008）和腸道沙門氏菌的 TlpA（Newmanet al. 2006），布魯氏菌 TI白包括 BtpA/TcpB 和 BtpB（Salcedo et al. 2013；Salcedo et al. 2008）。BtpA abortus 2308，B.abortus 9-941 和 B. melitensis 16 M 中，但不存在于 B. su suis S2 中，而 BtpB 存在于所有已測(cè)序的布魯氏菌菌株中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)pB 作為布魯氏菌重要的毒力因子，在逃避宿主免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要.2 BtpB 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)BtpB 是依賴布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)分子，與真核細(xì)胞 TIR 結(jié)構(gòu)源性（Newman et al. 2006）。探索 BtpB 結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，在 N 末端含有螺旋束參與同源二聚化，為特異性的磷脂酰肌醇磷酸酯的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；在 C 末端域（aa 144-256），屬于細(xì)菌 TLRs 的 Pfam家族中的 TIR-2。TIR 結(jié)構(gòu)域由中行 β-折疊（βA-βE），四周由五個(gè)螺旋（αA-αE）和連接環(huán)包圍。BB 環(huán)連接旋 αB，在介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的特異性中起重要作用（Spear et al. 2分 DD 環(huán)和 EE 環(huán)殘基側(cè)鏈隱藏在二聚體的結(jié)構(gòu)內(nèi)部。A
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2704941