【摘要】：牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD)是在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的重要傳染病,也是規(guī)�；B(yǎng)牛場和國際貿(mào)易中重點檢疫的牛傳染病。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)急性感染可導(dǎo)致牛外周血淋巴細(xì)胞(PBL)減少、凋亡和免疫抑制。在慢性病毒感染過程中PD-1信號通路可以介導(dǎo)協(xié)同抑制信號,抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖,誘導(dǎo)凋亡。然而,在急性病毒感染中PD-1通路對T細(xì)胞的調(diào)控作用并不明確。尤其是在BVDV急性感染中PD-1通路是否參與調(diào)控了PBL的減少和凋亡,促進免疫抑制的形成,尚不明確。為了確定PD-1通路是否與BVDV急性感染導(dǎo)致的牛PBL減少和凋亡具有相關(guān)性。首先,采用梯度密度水平離心法從BVDV急性感染牛頸靜脈抗凝血中分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC),再通過免疫微珠法從PBMC中分選出PBL和CD14~+外周血單核細(xì)胞(PBM),qRT-PCR和Western blot檢測兩種細(xì)胞亞群的PD-1和PD-L1表達水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測PBL凋亡,CCK-8法檢測PBL增殖。其次,選擇CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1KD株分別體外感染健康牛PBMC,再分選出PBL和CD14~+PBM,檢測PD-1和PD-L1表達水平,以及PBL增殖和凋亡情況。結(jié)果表明,與健康牛相比,BVDV急性感染牛PBL的PD-1 mRNA(p0.001)和蛋白表達水平(p0.01)顯著上調(diào),CD14~+PBM的PD-L1mRNA(p0.01)和蛋白表達(p0.01)顯著上調(diào),同時PBL的凋亡顯著增加(p0.001),增殖顯著減少。其次,CP和NCP型BVDV體外感染均可誘導(dǎo)PD-1和PD-L1 mRNA和蛋白表達的顯著上調(diào),隨著感染時間的延長PD-1和PD-L1 mRNA的表達水平逐漸升高,PD-1和PD-L1的表達上調(diào)伴隨著PBL凋亡顯著增加(p0.05)和增殖的顯著減少。為了確定阻斷PD-1通路對PBL凋亡和增殖的影響。選擇CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1 KD株分別體外感染健康牛PBMC,采用單抗阻斷PD-1通路,再通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PBL凋亡,CCK-8法檢測PBL增殖,ELISA檢測細(xì)胞因子分泌,以及qRT-PCR檢測病毒載量。結(jié)果表明,阻斷PD-1通路可以顯著減少BVDV體外感染導(dǎo)致的PBL凋亡(p0.05),恢復(fù)了PBL的增殖(CP型BVDV,p0.05),降低了病毒載量(p0.05),增加了IFN-γ(CP型BVDV,p0.01)和IL-2(p0.05)分泌水平。為了確定BVDV體外感染中阻斷PD-1通路對PBL亞群凋亡和增殖的影響。選擇CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1 KD株分別體外感染健康牛PBMC,通過免疫磁珠法分選CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞和CD21~+B細(xì)胞等PBL亞群,檢測PBL亞群PD-1蛋白表達情況。采用單抗體外阻斷PD-1通路,檢測PD-1阻斷對高表達PD-1的PBL亞群凋亡和增殖的影響。結(jié)果表明,CP和NCP型BVDV體外感染均能顯著提高CD4~+(CP型BVDV,p0.01;NCP型BVDV,p0.001)和CD8~+T細(xì)胞(CP型BVDV,p0.001;NCP型BVDV,p0.05)表面PD-1的表達,而CD21~+B細(xì)胞表面PD-1表達差異不顯著。此外,PD-1阻斷可以顯著減少CP和NCP型BVDV感染導(dǎo)致的CD4~+和CD8~+T細(xì)胞凋亡。在CP型BVDV感染中PD-1阻斷可以顯著恢復(fù)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖。但在NCP型BVDV感染中PD-1阻斷僅顯著恢復(fù)了CD4~+T細(xì)胞增殖。為了確定BVDV體外感染中PD-1通路調(diào)控CD4~+和CD8~+T細(xì)胞凋亡和增殖的分子機制。采用單抗體外阻斷PD-1通路,通過Western blot檢測PD-1通路下游調(diào)控凋亡和增殖的關(guān)鍵信號分子蛋白豐度和磷酸化水平。結(jié)果表明,在CP型BVDV體外感染中阻斷PD-1通路可以顯著上調(diào)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-ERK表達,同時顯著下調(diào)與凋亡有關(guān)的信號分子cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的表達。在NCP型感染中阻斷PD-1通路可以顯著上調(diào)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的p-PI3K和p-Akt的表達,下調(diào)cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3表達,此外,CD4~+T細(xì)胞p-mTOR的表達顯著上調(diào)(p0.01),但CD8~+T細(xì)胞中表達變化不顯著,CD4~+和CD8~+T細(xì)胞中p-ERK的表達變化均不顯著。綜上所述,CP型BVDV可以通過PD-1介導(dǎo)的協(xié)同抑制信號,抑制下游PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,激活caspase 9/caspase 3凋亡信號通路,進而抑制CD4~+和CD8~+T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡。NCP型BVDV通過PD-1通路抑制ERK通路,進而抑制CD4~+T細(xì)胞增殖,通過激活caspase 9/caspase 3通路,誘導(dǎo)CD4~+和CD8~+T細(xì)胞凋亡,但不能通過抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,來抑制CD8~+T細(xì)胞的增殖。我們推測NCP型BVDV可能通過PD-1以外的其他共抑制分子或多個共抑制分子協(xié)同介導(dǎo)的免疫負(fù)調(diào)控信號,抑制CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的增殖,該推論仍有待于進一步研究。本研究為探索BVDV免疫抑制的分子機制和抗PD-1治療藥物提供了科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

要特征的接觸性傳染病，該病廣泛分布于世界各地的養(yǎng)牛國家[1]，是養(yǎng)牛場和國際貿(mào)易重點檢疫的傳染病，給全世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[2]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）BVD-MD 列入必須通報的牛傳染病[3]，BVD-MD 已對我國乃至全世界的養(yǎng)牛業(yè)的健康、續(xù)發(fā)展造成了巨大的沖擊。1.1.1 病毒特性BVD-MD 的病原為牛病毒性腹瀉病毒（BVDV），屬黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病屬（Pestivirus）的成員[4]，同科成員還包括：乙肝病毒（HCV）、黃熱病毒（YFV）、西羅河病毒（WNV）、日本腦炎病毒（JEV）、登革熱病毒（DV）、豬瘟病毒（CSFV）和界病病毒（BDV）等[5]。病毒的基因組（Genome）為單股正鏈的 RNA，全長約 12.5 kb含有一個開放閱讀框架（ORF）[6]，Genome 被翻譯為一個多聚蛋白，，隨后在宿主細(xì)胞和毒的蛋白酶作用下被裂解為不同的病毒蛋白，包括 4 種結(jié)構(gòu)蛋白[7]（Core、Erns、E1 和 E和 8 種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）[8]（見圖 1-1

10圖 1-2 PD-1 及其下游主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（引自文獻[163]）Fig.1-2 PD-1 and its downstream signal transduction.2.4 PD-1 在病毒感染中的研究進展眾所周知，淋巴細(xì)胞（如 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞）在控制和清除病毒感染中清除病毒方面至關(guān)重要的作用。淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)不僅需要抗原特異性 TCR 識別抗原，還需要共分子，分為共刺激和共抑制分子。PD-1 作為一種共抑制分子，通過結(jié)合其配體（如 PD-L制 TCR 介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化，增殖，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡。在慢性病毒感染過程中 PD-1 對淋巴細(xì)胞的免疫負(fù)調(diào)控作用已被廣泛證實。PD-1 IV 特異性 CD8+T 細(xì)胞上顯著上調(diào)，其表達水平與病毒載量呈正相關(guān)[111]，與 CD4+T數(shù)量成負(fù)相關(guān)[112]。Barber 等發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中高表達 PD-1 的 CD8+T 細(xì)胞呈現(xiàn)功能
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 鄭怡娟;余雪平;蘇智軍;;BTLA及其負(fù)性調(diào)節(jié)慢性HBV感染的研究進展[J];中國免疫學(xué)雜志;2015年09期

2 童欽;呂曉妍;王煒;項鍵;;內(nèi)蒙古牛病毒性腹瀉病毒血清學(xué)調(diào)查[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2013年05期

3 楊得勝;林芬;魏良宇;吳波平;王琳轟;黃雁;洪英;;福建省牛病毒性腹瀉病的血清學(xué)調(diào)查[J];中國動物檢疫;2008年12期

4 李佑民,劉振潤,武銀蓮;牛病毒性腹瀉—粘膜病病毒株(長春184)的分離與鑒定[J];獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1983年02期

本文編號：2704036