【摘要】：牛支原體(ycoplasma bovis)是一種引起牛呼吸道疾病的病原體,隸屬于柔膜體綱,支原體目,支原體屬,沒有細(xì)胞壁,大小為0.2～0.3 μm。牛支原體1961年美國首次從患乳腺炎的乳汁中分離出來。1976年發(fā)現(xiàn)牛支原體與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。2008年國內(nèi)首次分離出牛支原體。牛支原體可以引起多種疾病,成為阻礙養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一大重要隱患。此病在全國范圍內(nèi)逐步蔓延,給我國的養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,疫苗的研發(fā)成為當(dāng)前重要的任務(wù)。纖維素具有無限延伸的能力,可以通過將纖維素分別與多個(gè)特異性蛋白質(zhì)相連接,并且防止其在自組裝或在表達(dá)過程中聚集,隨后在特定時(shí)間和地點(diǎn)誘導(dǎo)他們共同組裝。纖維素作為新型的免疫佐劑,具有良好的免疫增強(qiáng)作用,其特有的延伸功能為多聯(lián)疫苗的研制提供新的可能。本試驗(yàn)首先選取牛支原體特異性蛋白P48蛋白及P81蛋白。通過對牛支原體16SrRNA、P48、P81基因進(jìn)行擴(kuò)增,通過測序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化樹分析,證明牛支原體P48、P81具有高度保守性。隨后,運(yùn)用overlapPCR方法將P81基因序列中的TGA突變?yōu)槠渫x密碼子TGG,再與纖維素連接,通過原核表達(dá)方法表達(dá)P81重組蛋白;將純化后的PCR產(chǎn)物與pET-32(+)分別雙酶切后,進(jìn)行連接,將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-Tl感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)入BL31(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)P81蛋白。通過Westem-blottin驗(yàn)證,P81蛋白具有良好的反應(yīng)原性。并通過建立P81間接ELISA方法證明P81具有良好的特異性、敏感性;通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該蛋白作為亞單位疫苗對動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生良好的保護(hù),抵抗牛支原體的入侵,且產(chǎn)生高水平抗體效價(jià),21天時(shí)抗體滴度達(dá)到212。
【圖文】：

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邐內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文邐＿９＿逡逑２．２．４擴(kuò)增出基因組的測序、保存逡逑將膠回收的產(chǎn)物抽取２０ｐＬ送往生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測序，２５ｐＬ逡逑凍存－２０°Ｃ冰柜。逡逑２．３邋結(jié)果逡逑２．３．１分子生物學(xué)鑒定結(jié)果逡逑以純化后的菌株基因組為模板，各菌株均可擴(kuò)增到鑒定基因和所選擇的分子逡逑流調(diào)基因，１６ＳｒＲＮＡ片段大小約為１５００邋ｂｐ，邋Ｐ４８基因片段大小約為１４３０邋ｂｐ，逡逑Ｐ８１基因片段大小約２１００ｂｐ，均與預(yù)期大小相符。逡逑Ｍ邋Ｉ邋２邐３邐４邋５邋６邐７邋８邐９邐１０邐１１邐１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2703872