【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)是一種高度傳染性病毒,屬于套氏病毒目(Nidovirales)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。由PRRSV引起的豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)以引起各年齡段生長豬呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙為特征,是危害各國養(yǎng)豬業(yè)最重要的世界性經(jīng)濟(jì)疾病之一,目前缺乏有效的防控措施。mRNA脫帽增強(qiáng)因子3(Enhancer of mRNA decapping 3,EDC3)也稱LSm16、DCP3和YJDC,屬于LSm蛋白家族成員。EDC3定位于mRNA處理小體(Processing bodies,P-Body),是P-body重要組件蛋白。P-body是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的mRNA蛋白復(fù)合體,其組件蛋白與病毒存在相互作用關(guān)系。EDC3可激活包括DCP1、DCP2在內(nèi)的脫帽酶活性,參與mRNA 5’→3’降解過程。為探究PRRSV增殖過程中與EDC3蛋白的相互作用關(guān)系,本研究以從江香豬和Marc145細(xì)胞源EDC3基因?yàn)檠芯繉ο?通過克隆、測序獲得EDC3基因編碼區(qū)序列;建立EDC3基因qPCR方法,分析從江香豬不同組織間EDC3轉(zhuǎn)錄水平的差異;采用過表達(dá)與基因干擾技術(shù),從基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平初步探究EDC3蛋白與PRRSV增殖之間的作用關(guān)系,為進(jìn)一步探索EDC3蛋白與PRRSV相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),為防控PRRSV提供新策略。1.EDC3基因的克隆與生物信息學(xué)分析。利用RT-PCR方法對從江香豬、Marc145細(xì)胞源EDC3基因編碼區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增,并通過分子克隆技術(shù)將其克隆至pMD-19T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒;采用生物信息學(xué)方法對獲得EDC3序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明,從江香豬源EDC3基因長度為1404 bp,與預(yù)期大小相比缺少123 bp,缺失位置在277-399位堿基;Marc145細(xì)胞源EDC3基因長度為1527 bp,與預(yù)期大小相符;從江香豬與預(yù)測野豬(GenBank登錄號:XM_001927872)源EDC3核苷酸序列相似性最高,為99.7%;Marc145細(xì)胞與綠猴(GenBank登錄號:XM_008015876)源EDC3核苷酸序列相似性最高,為99.2%。EDC3具有LSm家族蛋白經(jīng)典結(jié)構(gòu)域,包括LSm結(jié)構(gòu)域、FDF結(jié)構(gòu)域、YjeF_N結(jié)構(gòu)域;EDC3蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明無規(guī)則卷曲和α-螺旋可能是其優(yōu)勢結(jié)構(gòu);EDC3是親水性蛋白,有多個(gè)抗原表位,無信號肽,不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。2.從江香豬EDC3基因熒光定量PCR方法的建立及其在不同組織的表達(dá)分析。建立香豬EDC3基因的qPCR方法,并對從江香豬不同組織EDC3的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明,EDC3基因在從江香豬肝、心、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)中均有表達(dá);在淋巴和脾臟等免疫器官轉(zhuǎn)錄水平相對較高,在肺臟中則最低,說明EDC3基因在從江香豬不同組織中呈不同程度分布。3.PRRSV增殖對EDC3表達(dá)的影響。Mac145細(xì)胞分別在0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h感染PRRSV,收集細(xì)胞,提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;利用qPCR方法檢測N基因、EDC3基因的mRNA水平,分析PRRSV增殖時(shí)對EDC3基因mRNA水平的影響。結(jié)果表明,正常情況下Mac145細(xì)胞中EDC3的mRNA水平在12 h-36 h趨于平穩(wěn);感染PRRSV后,隨著病毒的增殖,宿主細(xì)胞中EDC3的轉(zhuǎn)錄水平在24 h、36 h時(shí)顯著下調(diào)。說明PRRSV在增殖過程中對宿主細(xì)胞EDC3的mRNA水平有一定影響,本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究EDC3蛋白與PRRSV的作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。4.EDC3蛋白對PRRSV增殖的影響。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶豬源、猴源EDC3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將攜帶EDC3基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于Marc145細(xì)胞,利用IFA技術(shù)分析外源EDC3在Marc145細(xì)胞中的定位、通過qPCR及Western Blot方法對EDC3和PRRSV N基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析,探究EDC3過量表達(dá)時(shí)對PRRSV增殖的影響;合成針對Marc145細(xì)胞內(nèi)源EDC3 siRNA干擾引物,利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至Marc145細(xì)胞,探究抑制EDC3表達(dá)時(shí)對PRRSV增殖的影響。結(jié)果表明,經(jīng)雙酶切、測序驗(yàn)證,本研究成功構(gòu)建了豬源、猴源真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-pEDC3、pcDNA3.1-mEDC3,猴源EDC3定位于Marc145細(xì)胞胞漿內(nèi);過量表達(dá)EDC3并感染PRRSV時(shí),PRRSV N的mRNA、蛋白水平下調(diào),說明EDC3過量表達(dá)時(shí)可抑制PRRSV的增殖;EDC3 siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞后成功干擾了EDC3的表達(dá),同時(shí)感染PRRSV后,PRRSV N的mRNA、蛋白水平皆上調(diào),說明抑制EDC3表達(dá)能促進(jìn)PRRSV增殖。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探究EDC3蛋白與PRRSV增殖之間的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

因編碼蛋白信號肽預(yù)測alP 4.1 在線服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）因編碼區(qū) RT-PCR 結(jié)果豬源 cDNA 為模板，經(jīng)套式 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0% cDNA 為模板，經(jīng)特異性引物 PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.到約 1500 bp 左右條帶，與預(yù)期大小相符，結(jié)果如圖 1-1。M1bpM1bp

A: 從江香豬 EDC3 菌液 PCR 驗(yàn)證; B: Marc145 細(xì)胞源 EDC3 菌液 PM: DL 2000 DNA Marker; 1: 從江香豬、Marc145 細(xì)胞源 EDC3Fig.1-2 A: PCR Verification of EDC3 gene in Xiang Pig;B: PCR Verification of EDC3 gene in Marc145 cellsM: DL 2000 DNA Marker; 1: Xiang pig, Marc145 cell-derived EDC3因生物信息學(xué)分析結(jié)果測序分析結(jié)果R 驗(yàn)證為陽性的菌液送英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，獲對結(jié)果顯示：從江香豬源 EDC3 基因長度為 1404 bp，與預(yù)缺失部位在 277-399 堿基，，如圖 1-3 所示；Marc145 細(xì)胞源，與預(yù)期大小相符。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651

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本文編號：2697036