【摘要】：雞白痢沙門菌是一種宿主適應(yīng)性病原菌,多侵害20日齡以內(nèi)雛雞,發(fā)病率和死亡率極高。成年雞感染后產(chǎn)蛋率下降,雖臨床癥狀表現(xiàn)并不明顯,但可長期帶菌,以水平和垂直方式廣泛傳播病原,給全球特別是發(fā)展中國家的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。三型分泌系統(tǒng)(T3SS)是很多革蘭陰性菌用于侵襲宿主細(xì)胞的一種類針管注射器狀的結(jié)構(gòu)裝置。雞白痢沙門菌能夠利用T3SS編碼和分泌多種效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核宿主細(xì)胞中。由T3SS1編碼的效應(yīng)蛋白AvrA廣泛存在于腸道沙門菌的許多血清型中。不同于其他一些常見的效應(yīng)蛋白,AvrA雖然由病原菌分泌進(jìn)入宿主,但它卻能夠穩(wěn)定宿主細(xì)胞緊密連接,降低炎癥和抑制細(xì)胞凋亡。目前針對效應(yīng)蛋白AvrA的研究主要以鼠傷寒沙門菌為模型,但對于其在雞白痢沙門菌中所發(fā)揮功能的研究鮮有報道。蛋白序列分析結(jié)果顯示,與其它血清型沙門菌的AvrA蛋白相比,雞白痢沙門菌AvrA蛋白的竣基端缺失了 10個氨基酸。本研究采用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建雞白痢沙門菌avrA基因缺失株,初步探討了 AvrA與雞白痢沙門菌致病性的關(guān)系,為進(jìn)一步研究雞白痢沙門菌感染過程中AvrA蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。1雞白痢沙門菌avrA缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定本研究以λ-Red同源重組法對兩株雞白痢沙門菌S06004、C79-13的avrA基因進(jìn)行了敲除,成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌S06004、C79-13的avrA基因缺失株。將雞白痢沙門菌avrA基因和腸炎沙門菌avrA基因分別克隆至質(zhì)粒pBR322并電轉(zhuǎn)入缺失株中,分別構(gòu)建了S06004和C79-13回復(fù)有本源和腸炎沙門菌avrA基因的回復(fù)株,并比較了兩株雞白痢沙門菌野生株、avrA基因缺失株及avrA基因回復(fù)株的基本生物學(xué)特性。結(jié)果顯示:avrA基因的缺失不影響S06004和C79-13的生理生化特性,且缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究還利用重組DNA技術(shù),在載體pcDNA3.1(+)和pCMV-HA上構(gòu)建了雞白痢沙門菌AvrA的真核表達(dá)質(zhì)粒并將其導(dǎo)入大腸桿菌E.coli DH5α,通過間接免疫熒光,鑒定了 AvrA在HeLa等細(xì)胞中的表達(dá)。雞白痢沙門菌S06004和C79-13的avrA基因缺失株及其真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為后期研究AvrA在雞白痢沙門菌致病過程中發(fā)揮的作用提供了相應(yīng)的生物材料。2雞白痢沙門菌avrA缺失株體外感染過程中調(diào)控細(xì)胞炎性反應(yīng)將AvrA真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa、LMH細(xì)胞后,利用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示,AvrA真核表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa、LMH細(xì)胞后,NF-κB信號通路底物活性下調(diào),表明雞白痢沙門菌效應(yīng)蛋白AvrA可以抑制NF-κB的活化。鑒于AvrA在雞白痢沙門菌中存在部分序列的缺失,我們加入腸炎沙門菌的AvrA進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門菌AvrA對TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路活性的抑制能力要弱于腸炎沙門菌AvrA,表明在真核轉(zhuǎn)染水平上,雞白痢沙門菌avrA缺失片段降低其抑制NF-κB通路活化的能力。將雞白痢沙門菌野生株、缺失株、回復(fù)株感染HeLa細(xì)胞和Caco-2BBE細(xì)胞,檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清的炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示,缺失株感染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的炎性因子IL-6、IL-8顯著高于野生株感染組,說明雞白痢沙門菌效應(yīng)蛋白AvrA在沙門菌對宿主炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮抑炎效應(yīng)。另外,回復(fù)本源AvrA的回復(fù)株感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清中,炎性因子的水平低于回復(fù)外源AvrA的回復(fù)株,表明不同血清型中的AvrA只能夠在本源血清型沙門菌中發(fā)揮更好的抑炎效應(yīng)。雞白痢沙門菌野生株S06004和C79-13、avrA基因缺失株及回復(fù)株感染HeLa、Caco-2BBE細(xì)胞后,Western-blot檢測相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,雞白痢沙門菌AvrA能夠抑制p-JNK、Beclin-1蛋白的表達(dá)水平,其avrA基因缺失片段不顯著影響AvrA的效應(yīng)功能,AvrA能夠在本源血清型沙門菌中發(fā)揮對p-JNK、Beclin-1更好的抑制效果。激光共聚焦結(jié)果顯示,雞白痢沙門菌AvrA能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65入核。本研究初步闡明雞白痢沙門菌AvrA在雞白痢沙門菌引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮的抑炎作用。
【圖文】：

夠編碼這兩種毒力相關(guān)的三型分泌系統(tǒng)，分泌４０多種效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核宿主細(xì)胞［２１－２３］，這逡逑些效應(yīng)蛋白通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號通路和胞內(nèi)活動以利于病原菌侵入宿主細(xì)胞和在胞內(nèi)逡逑的存活（圖１）。當(dāng)腸道沙門菌感染宿主后，病原菌與腸道上皮細(xì)胞接觸，Ｔ３ＳＳ１被激活，逡逑而后Ｔ３ＳＳ１將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，其中部分效應(yīng)蛋白參與誘導(dǎo)局部細(xì)胞膜皺裂以幫助逡逑細(xì)菌侵襲。Ｔ３ＳＳ１效應(yīng)蛋白還觸發(fā)促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途徑的激活，產(chǎn)生促逡逑炎細(xì)胞因子，招募多形核白細(xì)胞（ＰＭＮｓ），誘導(dǎo)腸道的急性炎癥。Ｔ３ＳＳ２存在于所有腸道逡逑沙門菌亞種中，該系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)運效應(yīng)蛋白穿過ＳＣＶ泡進(jìn)入胞質(zhì)中，調(diào)控胞內(nèi)ｐＨ酸性環(huán)境逡逑和ＳＣＶ泡內(nèi)的成分，穩(wěn)定沙門菌與宿主細(xì)胞的互作環(huán)境［２４］�？傊抽T菌通過Ｔ３ＳＳ系統(tǒng)逡逑把效應(yīng)蛋白注射入真核宿主細(xì)胞中，效應(yīng)蛋白又通過協(xié)同作用的方式發(fā)揮效應(yīng)，改造宿主逡逑細(xì)胞的功能，破壞機(jī)體的免疫力，建立一個有利于病原菌生存和增殖的胞內(nèi)環(huán)境？，雖然部逡逑分效應(yīng)蛋白之間的功能相反

邐３逡逑Ｔ３ＳＳ１效應(yīng)蛋白ＡｖｒＡ能夠穩(wěn)定緊密連接（圖２）邋０１。逡逑ＡｖｒＡ蛋白大小３３ＫＤａ邋（表１），存在于８０％的腸道沙門菌血清型中［３（），３１］，在沙門菌侵逡逑襲的早期由Ｔ３ＳＳ１分泌進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞［３２］，，但也有報道稱其分泌與Ｔ３ＳＳ２相關(guān)［３３］。作逡逑為Ｔ３ＳＳ１的一種效應(yīng)蛋白，ａｖｒ／４基因序列和假結(jié)核耶爾森鼠疫桿菌（逡逑的少ｏ／ｘ／基因以及番前瘡痂病辣椒斑點病菌（Ｘ＜３扣／ｚｏｍｏ／~|ｃａｍｐｅ幼Ｉｓｐｖ．逡逑ｖｅｓ／ｃａ／ｏｎ＿ａ）的ａｖ／７？ｘｖ基因序歹�。氏嗨疲郏常Ｔ缙谘芯坷檬髠抽T菌ｐｈｏ－２４及其ａｖｎ４基逡逑因缺失株感染人宮頸癌上皮細(xì)胞ＨｅＬａ來研究ＡｖｒＡ的瞬時表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌ｐｈｏ－逡逑２４的ａｖｄ基因突變株能夠誘導(dǎo)ＰｈｏＱ／ＰｈｏＰ雙組份系統(tǒng)的激活，并揭示ＡｖｒＡ可抑制ＮＦ－逡逑ｋＢ路徑在果蠅和小鼠模型里，ＪＮＫ和ＮＦ－ｋＢ路徑抑制后，先天免疫受阻，炎癥和凋逡逑亡加強(qiáng)［３６］？研究發(fā)現(xiàn)在假結(jié)核耶爾森菌（ＹｏｐＪ／Ｐ）和副溶血弧菌（ＶｏｐＰ）中，ＡｖｒＡ作為一逡逑種乙酰轉(zhuǎn)移酶而存在ＡｖｒＡ過表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型里
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

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本文編號：2696600