【摘要】：雞白痢沙門(mén)菌是一種宿主適應(yīng)性病原菌,多侵害20日齡以?xún)?nèi)雛雞,發(fā)病率和死亡率極高。成年雞感染后產(chǎn)蛋率下降,雖臨床癥狀表現(xiàn)并不明顯,但可長(zhǎng)期帶菌,以水平和垂直方式廣泛傳播病原,給全球特別是發(fā)展中國(guó)家的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。三型分泌系統(tǒng)(T3SS)是很多革蘭陰性菌用于侵襲宿主細(xì)胞的一種類(lèi)針管注射器狀的結(jié)構(gòu)裝置。雞白痢沙門(mén)菌能夠利用T3SS編碼和分泌多種效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核宿主細(xì)胞中。由T3SS1編碼的效應(yīng)蛋白AvrA廣泛存在于腸道沙門(mén)菌的許多血清型中。不同于其他一些常見(jiàn)的效應(yīng)蛋白,AvrA雖然由病原菌分泌進(jìn)入宿主,但它卻能夠穩(wěn)定宿主細(xì)胞緊密連接,降低炎癥和抑制細(xì)胞凋亡。目前針對(duì)效應(yīng)蛋白AvrA的研究主要以鼠傷寒沙門(mén)菌為模型,但對(duì)于其在雞白痢沙門(mén)菌中所發(fā)揮功能的研究鮮有報(bào)道。蛋白序列分析結(jié)果顯示,與其它血清型沙門(mén)菌的AvrA蛋白相比,雞白痢沙門(mén)菌AvrA蛋白的竣基端缺失了 10個(gè)氨基酸。本研究采用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建雞白痢沙門(mén)菌avrA基因缺失株,初步探討了 AvrA與雞白痢沙門(mén)菌致病性的關(guān)系,為進(jìn)一步研究雞白痢沙門(mén)菌感染過(guò)程中AvrA蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。1雞白痢沙門(mén)菌avrA缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定本研究以λ-Red同源重組法對(duì)兩株雞白痢沙門(mén)菌S06004、C79-13的avrA基因進(jìn)行了敲除,成功構(gòu)建了雞白痢沙門(mén)菌S06004、C79-13的avrA基因缺失株。將雞白痢沙門(mén)菌avrA基因和腸炎沙門(mén)菌avrA基因分別克隆至質(zhì)粒pBR322并電轉(zhuǎn)入缺失株中,分別構(gòu)建了S06004和C79-13回復(fù)有本源和腸炎沙門(mén)菌avrA基因的回復(fù)株,并比較了兩株雞白痢沙門(mén)菌野生株、avrA基因缺失株及avrA基因回復(fù)株的基本生物學(xué)特性。結(jié)果顯示:avrA基因的缺失不影響S06004和C79-13的生理生化特性,且缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究還利用重組DNA技術(shù),在載體pcDNA3.1(+)和pCMV-HA上構(gòu)建了雞白痢沙門(mén)菌AvrA的真核表達(dá)質(zhì)粒并將其導(dǎo)入大腸桿菌E.coli DH5α,通過(guò)間接免疫熒光,鑒定了 AvrA在HeLa等細(xì)胞中的表達(dá)。雞白痢沙門(mén)菌S06004和C79-13的avrA基因缺失株及其真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為后期研究AvrA在雞白痢沙門(mén)菌致病過(guò)程中發(fā)揮的作用提供了相應(yīng)的生物材料。2雞白痢沙門(mén)菌avrA缺失株體外感染過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞炎性反應(yīng)將AvrA真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa、LMH細(xì)胞后,利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示,AvrA真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T、HeLa、LMH細(xì)胞后,NF-κB信號(hào)通路底物活性下調(diào),表明雞白痢沙門(mén)菌效應(yīng)蛋白AvrA可以抑制NF-κB的活化。鑒于AvrA在雞白痢沙門(mén)菌中存在部分序列的缺失,我們加入腸炎沙門(mén)菌的AvrA進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門(mén)菌AvrA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路活性的抑制能力要弱于腸炎沙門(mén)菌AvrA,表明在真核轉(zhuǎn)染水平上,雞白痢沙門(mén)菌avrA缺失片段降低其抑制NF-κB通路活化的能力。將雞白痢沙門(mén)菌野生株、缺失株、回復(fù)株感染HeLa細(xì)胞和Caco-2BBE細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示,缺失株感染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的炎性因子IL-6、IL-8顯著高于野生株感染組,說(shuō)明雞白痢沙門(mén)菌效應(yīng)蛋白AvrA在沙門(mén)菌對(duì)宿主炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮抑炎效應(yīng)。另外,回復(fù)本源AvrA的回復(fù)株感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清中,炎性因子的水平低于回復(fù)外源AvrA的回復(fù)株,表明不同血清型中的AvrA只能夠在本源血清型沙門(mén)菌中發(fā)揮更好的抑炎效應(yīng)。雞白痢沙門(mén)菌野生株S06004和C79-13、avrA基因缺失株及回復(fù)株感染HeLa、Caco-2BBE細(xì)胞后,Western-blot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,雞白痢沙門(mén)菌AvrA能夠抑制p-JNK、Beclin-1蛋白的表達(dá)水平,其avrA基因缺失片段不顯著影響AvrA的效應(yīng)功能,AvrA能夠在本源血清型沙門(mén)菌中發(fā)揮對(duì)p-JNK、Beclin-1更好的抑制效果。激光共聚焦結(jié)果顯示,雞白痢沙門(mén)菌AvrA能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65入核。本研究初步闡明雞白痢沙門(mén)菌AvrA在雞白痢沙門(mén)菌引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮的抑炎作用。
【圖文】：

夠編碼這兩種毒力相關(guān)的三型分泌系統(tǒng)，分泌４０多種效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核宿主細(xì)胞［２１－２３］，這逡逑些效應(yīng)蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號(hào)通路和胞內(nèi)活動(dòng)以利于病原菌侵入宿主細(xì)胞和在胞內(nèi)逡逑的存活（圖１）。當(dāng)腸道沙門(mén)菌感染宿主后，病原菌與腸道上皮細(xì)胞接觸，Ｔ３ＳＳ１被激活，逡逑而后Ｔ３ＳＳ１將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，其中部分效應(yīng)蛋白參與誘導(dǎo)局部細(xì)胞膜皺裂以幫助逡逑細(xì)菌侵襲。Ｔ３ＳＳ１效應(yīng)蛋白還觸發(fā)促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途徑的激活，產(chǎn)生促逡逑炎細(xì)胞因子，招募多形核白細(xì)胞（ＰＭＮｓ），誘導(dǎo)腸道的急性炎癥。Ｔ３ＳＳ２存在于所有腸道逡逑沙門(mén)菌亞種中，該系統(tǒng)通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)蛋白穿過(guò)ＳＣＶ泡進(jìn)入胞質(zhì)中，調(diào)控胞內(nèi)ｐＨ酸性環(huán)境逡逑和ＳＣＶ泡內(nèi)的成分，穩(wěn)定沙門(mén)菌與宿主細(xì)胞的互作環(huán)境［２４］�？傊�，沙門(mén)菌通過(guò)Ｔ３ＳＳ系統(tǒng)逡逑把效應(yīng)蛋白注射入真核宿主細(xì)胞中，效應(yīng)蛋白又通過(guò)協(xié)同作用的方式發(fā)揮效應(yīng)，改造宿主逡逑細(xì)胞的功能，破壞機(jī)體的免疫力，建立一個(gè)有利于病原菌生存和增殖的胞內(nèi)環(huán)境？，雖然部逡逑分效應(yīng)蛋白之間的功能相反

邐３逡逑Ｔ３ＳＳ１效應(yīng)蛋白ＡｖｒＡ能夠穩(wěn)定緊密連接（圖２）邋０１。逡逑ＡｖｒＡ蛋白大�。常常耍模徨澹ū恚保�，存在于８０％的腸道沙門(mén)菌血清型中［３（），３１］，在沙門(mén)菌侵逡逑襲的早期由Ｔ３ＳＳ１分泌進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞［３２］，，但也有報(bào)道稱(chēng)其分泌與Ｔ３ＳＳ２相關(guān)［３３］。作逡逑為Ｔ３ＳＳ１的一種效應(yīng)蛋白，ａｖｒ／４基因序列和假結(jié)核耶爾森鼠疫桿菌（逡逑的少ｏ／ｘ／基因以及番前瘡痂病辣椒斑點(diǎn)病菌（Ｘ＜３扣／ｚｏｍｏ／~|ｃａｍｐｅ幼Ｉｓｐｖ．逡逑ｖｅｓ／ｃａ／ｏｎ＿ａ）的ａｖ／７？ｘｖ基因序歹�。氏嗨疲郏常�。早期研究利用鼠傷寒沙門(mén)菌ｐｈｏ－２４及其ａｖｎ４基逡逑因缺失株感染人宮頸癌上皮細(xì)胞ＨｅＬａ來(lái)研究ＡｖｒＡ的瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)菌ｐｈｏ－逡逑２４的ａｖｄ基因突變株能夠誘導(dǎo)ＰｈｏＱ／ＰｈｏＰ雙組份系統(tǒng)的激活，并揭示ＡｖｒＡ可抑制ＮＦ－逡逑ｋＢ路徑在果蠅和小鼠模型里，ＪＮＫ和ＮＦ－ｋＢ路徑抑制后，先天免疫受阻，炎癥和凋逡逑亡加強(qiáng)［３６］？研究發(fā)現(xiàn)在假結(jié)核耶爾森菌（ＹｏｐＪ／Ｐ）和副溶血弧菌（ＶｏｐＰ）中，ＡｖｒＡ作為一逡逑種乙酰轉(zhuǎn)移酶而存在ＡｖｒＡ過(guò)表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型里
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 萬(wàn)愛(ài)軍;;雞白痢的凈化與防控[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2017年11期

2 王昊;;中藥在雞白痢治療中的應(yīng)用[J];當(dāng)代畜牧;2017年17期

3 王祥明;;種雞場(chǎng)雞白痢的檢疫和凈化管理措施[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2018年01期

4 杜穎;;引起雞白痢的原因和預(yù)防[J];今日畜牧獸醫(yī);2017年12期

5 余春林;楊朝武;邱莫寒;尹華東;虎彪;胡陳明;夏波;宋小燕;熊霞;;雞白痢綜合防控措施[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2018年02期

6 羅亦云;;禽病清散治療雞白痢的療效分析[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2018年02期

7 翟銀建;劉雪梅;劉磊;沈?qū)W懷;張丹俊;;安徽地區(qū)雞白痢血清流行病學(xué)調(diào)查[J];中國(guó)畜禽種業(yè);2018年07期

8 楊定坤;;雞白痢的診斷與防治措施[J];農(nóng)民致富之友;2018年17期

9 張衍俊;李?lèi)?ài)芹;商好獻(xiàn);鄭麗艷;;硫酸頭孢喹肟對(duì)雞白痢的臨床治療[J];中國(guó)動(dòng)物保健;2018年09期

10 韋存莉;夏長(zhǎng)保;;雞白痢及其綜合防控措施[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2016年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 郭榮顯;耿士忠;焦紅梅;錢(qián)珊珊;薛穎;安樹(shù)敏;潘志明;焦新安;;減毒雞白痢沙門(mén)菌菌影的制備及免疫原性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

2 耿士忠;郭榮顯;焦新安;;雞白痢沙門(mén)菌轉(zhuǎn)座子信號(hào)標(biāo)簽突變庫(kù)的構(gòu)建及毒力相關(guān)基因的篩選[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

3 郭秀玲;;雞白痢的診斷與防治[A];2010畜牧業(yè)與低碳經(jīng)濟(jì)科技論文集[C];2010年

4 涂玉蓉;陳建紅;張濟(jì)培;牛森;任濤;;68株雞白痢沙門(mén)菌藥物敏感性測(cè)定與分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

5 涂玉蓉;陳建紅;張濟(jì)培;任濤;牛森;張秋姜;;雞白痢和雞傷寒沙門(mén)氏菌的PCR-RFLP鑒別[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

6 陳建紅;張濟(jì)培;司興奎;歐耀棠;張素濃;黃可恒;;雞白痢沙門(mén)菌不同成分誘導(dǎo)小雞免疫應(yīng)答的探討[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

7 陳建紅;張濟(jì)培;梁錦泉;黃可恒;張素濃;陳偉拓;;小雞雞白痢感染途徑的探討[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 陳建紅;張濟(jì)培;司興奎;簡(jiǎn)志光;張秋姜;黃可恒;;小雞雞白痢抗體水平與抗感染關(guān)系的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

9 龔建森;劉學(xué)賢;徐步;王鑫;俞燕;劉加圣;;雞白痢沙門(mén)菌凍干菌種的長(zhǎng)期保存試驗(yàn)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家禽學(xué)分會(huì)第九次代表會(huì)議暨第十六次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

10 余慶;代娜;周偉;劉曉麗;胡薛英;張萬(wàn)坡;谷長(zhǎng)勤;程國(guó)富;;利用原位雜交檢測(cè)石蠟切片中雞白痢沙門(mén)菌在各組織的分布[A];中國(guó)獸醫(yī)病理學(xué)2017年學(xué)術(shù)研討會(huì)暨獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)論文集[C];2017年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 肅文;防治雞白痢的方法[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2013年

2 省畜牧獸醫(yī)研究所 胡雄貴;防治雞白痢[N];湖南科技報(bào);2009年

3 林偉;產(chǎn)蛋雞禁用五類(lèi)藥[N];河南科技報(bào);2009年

4 胡喜善;冬季給雞驅(qū)蟲(chóng)好[N];新疆科技報(bào)(漢);2009年

5 宜陽(yáng)縣畜牧局 張俊芳 李江波 方社挽;雞白痢的防控措施[N];河南科技報(bào);2008年

6 江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所 劉宇卓;雞白痢[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2004年

7 沈慧;種雞場(chǎng)如何預(yù)防雞白痢[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2005年

8 任丘市畜牧水產(chǎn)局 李瑞典 劉艷芬;注意防治雞白痢[N];河北科技報(bào);2009年

9 李金統(tǒng);雞白痢、傷寒、副傷寒如何診治[N];中國(guó)畜牧報(bào);2002年

10 山西恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司技術(shù)支持部 王華聽(tīng);成雞白痢莫大意[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李求春;利用IVIAT技術(shù)篩選雞白痢沙門(mén)菌體內(nèi)感染相關(guān)因子及pSPI12質(zhì)粒的鑒定與IpaJ蛋白的功能分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 滿(mǎn)成連;雞白痢沙門(mén)菌LPS合成和生物被膜形成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

2 劉子健;雞白痢沙門(mén)菌avrA缺失株的構(gòu)建及AvrA蛋白抑炎效應(yīng)的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

3 徐黎娟;基于ipaJ基因鑒定雞白痢沙門(mén)菌PCR方法的建立及IpaJ抑制宿主NF-κB信號(hào)通路機(jī)制的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

4 許瑩;雞白痢/雞傷寒診斷方法的建立與初步應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

5 翟崇凱;攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門(mén)菌構(gòu)建及其特性[D];河南科技大學(xué);2017年

6 夏頡;雞白痢沙門(mén)菌感染細(xì)胞形成SCV的規(guī)律研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

7 楊曉輝;關(guān)中地區(qū)雞白痢感染現(xiàn)狀的調(diào)查及臭氧對(duì)其防治效果的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

8 袁玉玉;雞白痢沙門(mén)菌噬菌體的分離鑒定及其初步應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

9 黃小雨;不同飼養(yǎng)模式對(duì)黃山黑雞J亞群禽白血病、雞白痢感染情況的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 方麗君;選擇性捕獲雞白痢沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2696600