【摘要】：化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一種革蘭氏陽(yáng)性、不規(guī)則、無運(yùn)動(dòng)性及不含孢子結(jié)構(gòu)的短桿菌。它被認(rèn)為是一種廣泛存在于家畜黏膜表面的較為常見的機(jī)會(huì)性致病菌,可引起宿主發(fā)生多種器官化膿性感染。溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes主要的毒力因子之一,其作為一種外毒素,具有溶解細(xì)胞的生物學(xué)特性。與其他膽固醇依賴性溶細(xì)胞家族(Family of cholesterol-dependent cytolysin,CDCs)相同,PLO蛋白分子具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域,其第四結(jié)構(gòu)域(Domain 4,D4)的作用是識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞膜上的膽固醇。本研究制備出了 5 株針對(duì) PLO D4 的 mAbs(monoclonal antibody,mAb),其中 4 株(2G3、3C8、3G10、4C9)具有較強(qiáng)的抗溶血活性,而3C7的抗溶血活性較低。通過Western-blot法進(jìn)行表位區(qū)篩選,結(jié)果表明3C7所針對(duì)的表位區(qū)位于PLO前體(含27個(gè)氨基酸信號(hào)肽)的第519-534位氨基酸(amino acid,AA)(以下簡(jiǎn)稱PLO 519-534AA),而具有較強(qiáng)抗溶血活性的4株mAbs所針對(duì)的表位區(qū)位于PLO前體第487-502位氨基酸(以下簡(jiǎn)稱PLO 487-502AA)處,這段表位區(qū)包含了完整的十一肽基序(PLO 491-501AA),證實(shí)了十一肽基序?qū)LO溶血活性有著重要的影響。上述5株mAbs均可以與由T.pyogenes培養(yǎng)物粗純化獲得的天然PLO(wild type PLO,wtPLO)反應(yīng)。說明5株mAbs可以用于wtPLO的檢測(cè)。由于2G3的ELISA反應(yīng)效價(jià)顯著高于其他4株mAbs,因此使用2G3作為捕獲抗體,配合本實(shí)驗(yàn)室已保存的HRP標(biāo)記的抗PLOmAb(HRP-AP-1A3)建立并優(yōu)化了雙抗體夾心ELISA方法。根據(jù)此方法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)TpyogenesHLJ-0912株和T.pyogenes HLJ-1005株分泌在培養(yǎng)液中的wtPLO含量,并在T.yogenes HLJ-0912株培養(yǎng)到10-14 h之間時(shí)可以檢測(cè)到其培養(yǎng)物中的PLO含量。綜上所述,本研究成功制備了 5株mAbs,并確定了其所針對(duì)的2個(gè)表位區(qū);且表明了能夠識(shí)別十一肽基序的mAbs可以有效抑制PLO的溶血活性。同時(shí)使用雙抗體夾心ELISA方法對(duì)Tpyogenes HLJ-0912株分泌在液體培養(yǎng)基內(nèi)的PLO進(jìn)行定量分析,為T.pyogenes的毒力分析提供了依據(jù)。
【圖文】：

白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：濃縮后ecular weight marker; 1: The c-1 rPLO 蛋白 SDS-PAGE3-1 SDS-PAGE analysis o見步驟 2.2.1，，經(jīng)純化、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：濃縮后的ular weight marker; 1: The con

子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：濃縮后的 rPar weight marker; 1: The concenrPLO 蛋白 SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE analysis of rPL步驟 2.2.1，經(jīng)純化、透析
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 唐婕;劉二龍;盧麗;李斐然;王永奇;劉文華;;林麝源化膿隱秘桿菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年03期

2 劉萍;陳苗苗;劉學(xué)榮;牟克斌;黃銀君;;單克隆抗體研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2012年01期

3 田凱;王秋霞;郭文潔;朱竟赫;劉耀川;劉明春;;化膿隱秘桿菌溶血素的研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2010年12期

4 喬旭;吳芬芳;蘇鵬;李慶偉;;CDC/MACPF家族成孔毒素研究進(jìn)展[J];遺傳;2010年11期

本文編號(hào)：2696580