【摘要】：哺乳動(dòng)物精子生成的過(guò)程主要是睪丸生殖細(xì)胞經(jīng)分化過(guò)程后形成精原細(xì)胞,再通過(guò)一系列復(fù)雜的生物學(xué)變化,最終分化成成熟精子。精子形成過(guò)程中受各種因子和細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié),其中包括染色體結(jié)構(gòu)變化,一些內(nèi)源的調(diào)節(jié)因子和基因的一系列復(fù)雜的程序性表達(dá)調(diào)控。睪丸發(fā)育特異性蛋白-27基因(Testis development specific protein gene 27,NYD-SP27)作為磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的抑制劑,是精子形成的調(diào)節(jié)劑,對(duì)精子的產(chǎn)生具有重要的調(diào)控作用。[目的]本研究主要目的是將NYD-SP27基因的上調(diào)和下調(diào)載體質(zhì)粒通過(guò)睪丸注射后,探究它對(duì)綿羊精子活率、畸形率、血清中生殖激素水平以及精子cAMP信號(hào)通路中關(guān)鍵酶的表達(dá)量等方面的影響,以揭示NYD-SP27基因在精子形成過(guò)程中分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。[方法](1)本研究以Genbank中的綿羊NYD-SP27基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,克隆羊NYD-SP27基因,將基因連接到真核載體pmcherry-n1中;載體的紅色熒光蛋白和目的基因通過(guò)豬捷申病毒2 A肽(P2A)連接以實(shí)現(xiàn)共表達(dá);(2)將NYD-SP27基因的上調(diào)和下調(diào)載體質(zhì)粒通過(guò)睪丸注射后,電刺激采精,檢測(cè)NYD-SP27基因?qū)d羊精子活率和畸形率的影響;并制作凍精,解凍后檢測(cè)NYD-SP27基因?qū)又屑?dòng)蛋白和肌球蛋白的影響;(3)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)NYD-SP27基因?qū)觾?nèi)cAMP信號(hào)通路中相關(guān)酶的表達(dá)量的影響;(4)將NYD-SP27基因的上調(diào)和下調(diào)載體質(zhì)粒通過(guò)綿羊睪丸注射后,采集血液,檢測(cè)血清中生殖激素水平。[結(jié)果](1)成功構(gòu)建了pmcherry-Flag-NYDSP-P2A真核表達(dá)重組載體;(2)對(duì)照組與FNP組(NYD-SP27基因的上調(diào))精子活率差異不顯著(P0.05),對(duì)照組與Sh組(NYD-SP27基因的下調(diào))卻差異顯著(P0.05);對(duì)照組與試驗(yàn)組(FNP組和Sh組)精子畸形率差異均不顯著(P0.05);對(duì)照組與FNP組綿羊精子中肌動(dòng)蛋白表達(dá)量差異不顯著(P0.05),對(duì)照組與Sh組卻差異極顯著(P0.01);對(duì)照組與試驗(yàn)組精子中肌球蛋白的表達(dá)量差異均極顯著(P0.01);(3)對(duì)照組與Sh組綿羊精子中環(huán)磷酸腺苷酸的表達(dá)量差異顯著(P0.05),對(duì)照組與FNP組卻差異極顯著(P0.01);對(duì)照組與Sh組綿羊精子中蛋白激酶的表達(dá)量差異不顯著(P0.05),對(duì)照組與FNP組卻差異顯著(P0.05);(4)NYD-SP27基因下調(diào)(Sh組)對(duì)綿羊睪酮水平的分泌具有促進(jìn)作用。[結(jié)論](1)在NYD-SP27基因表達(dá)蛋白和紅色熒光蛋白翻譯過(guò)程中豬捷申病毒2A肽片段起到了剪切作用;(2)NYD-SP27基因下調(diào)不僅對(duì)可以促進(jìn)綿羊精子活率的提高,并對(duì)精子中肌動(dòng)蛋白亦產(chǎn)生調(diào)控作用;(3)NYD-SP27基因下調(diào)對(duì)精子cAMP信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的環(huán)磷酸腺苷酸和蛋白激酶的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用;(4)NYD-SP27基因下調(diào)對(duì)綿羊睪酮水平的分泌產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

圖 1 鈣離子動(dòng)員的信使與調(diào)節(jié)組成(引自 Michael J. Berridge， 2003)composition of messenger and regulation of calcium ion mobilization (from MicBerridge， 2003)胞培養(yǎng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，，PLC 被 Ca2+激活，并且在激活后引起 PI2 水解成三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)。因此，當(dāng)水解的 I

P2A合成產(chǎn)物M.標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1.P2A100bp74bp
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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5 王若s

本文編號(hào)：2696353