【摘要】：禽流感是由A型流感病毒引起的急性傳染病,主要侵害禽類的呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)。在我國主要存在LPAI和HPAI兩種類型的禽流感病毒,禽流感病毒毒株的不同亞型同時存在也是普遍現(xiàn)象。HPAI占我國禽流感發(fā)生次數(shù)的90%以上,在東中西部很多地區(qū)均有爆發(fā)且發(fā)病率、死亡率均比較高,致死率高達(dá)70%以上,對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病主要靠滅活疫苗接種來預(yù)防控制,在我國對HPAI農(nóng)業(yè)部采取強制免疫。由于禽流感病毒基因突變率很高,尤其主要保護(hù)性抗原的HA基因突變非常頻繁,使得H5亞型高致病性禽流感病毒出現(xiàn)了很多不同的病毒株,但是疫苗毒株相對滯后,同時滅活疫苗存在免疫劑量大、免疫副反應(yīng)強、干擾流行病學(xué)檢測等諸多缺點。禽流感DNA疫苗在激活體液免疫的同時也能誘發(fā)細(xì)胞免疫,而且免疫副反應(yīng)小,不涉及病毒擴散等優(yōu)點,其有望成為滅活疫苗的替代產(chǎn)品,國外已經(jīng)有禽流感的商品化核酸疫苗,禽流感H5亞型DH5α-pCAGGoptiHA5 DNA疫苗新獸藥核發(fā)已通過。重組菌的小規(guī)模培養(yǎng)和質(zhì)粒小量提取技術(shù),在實驗室已經(jīng)是非常成熟的技術(shù),但是要規(guī)�；瘧�(yīng)用于獸用疫苗生產(chǎn)有較大困難,獲得規(guī)模化高效表達(dá)和高效率提純是當(dāng)前主要瓶頸,DNA疫苗生產(chǎn)工藝優(yōu)化是當(dāng)前迫切需要。本研究摸索了在100L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基篩選并建立了種子庫,優(yōu)化了DH5α-pCAGGoptiHA5規(guī)�；囵B(yǎng)的參數(shù)條件,并進(jìn)一步對放大至1000L發(fā)酵罐中禽流感DNA生產(chǎn)工藝進(jìn)行了更為詳細(xì)的參數(shù)研究。此外,對生產(chǎn)的DNA疫苗進(jìn)行了免疫研究,探索DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用的可能性,為其它產(chǎn)品工藝和產(chǎn)品應(yīng)用提供有效參考。結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法、響應(yīng)面法、最陡爬坡法對DH5α-pCAGGoptiHA5培養(yǎng)工藝的各因素優(yōu)化研究,篩選出培養(yǎng)基優(yōu)化配方:胰蛋白胨(10g/L),蔗糖(17.5g/L),酵母粉(7.5g/L),硫酸銨(7.5g/L),NaCl(10g/L),利用100L反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng),最終質(zhì)粒濃度為115.25mg/L,產(chǎn)量提高88.52%。菌株經(jīng)連續(xù)傳15代后,通過菌培養(yǎng)特性和質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性篩選,得到適應(yīng)性良好的菌株15株,成功建立了菌種庫,該菌株質(zhì)粒非常穩(wěn)定,且純凈性較好。通過規(guī)�；a(chǎn)后,該菌種的質(zhì)粒穩(wěn)定性也非常好。通過對生產(chǎn)過程中主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化實驗,利用1000L發(fā)酵罐,成功進(jìn)行了規(guī)�；糯笊a(chǎn)。結(jié)果顯示在接種量8%、溶氧30%的補料發(fā)酵,37.0℃轉(zhuǎn)42.0℃溫度誘導(dǎo)5h,質(zhì)粒產(chǎn)量高達(dá)359.2mg/L,產(chǎn)量提高108.9%,具有可重復(fù)性,為規(guī)�；a(chǎn)提供有效數(shù)據(jù)。利用改進(jìn)的裂解提取法,采用自主研發(fā)的裂解儀、絮狀物去除儀、切向流過濾組合工藝,使裂解效率提高15倍,質(zhì)粒回收效率提高了18.74%,質(zhì)粒純度良好。利用質(zhì)粒制備的禽流感DNA疫苗進(jìn)行了免疫實驗,20μg質(zhì)粒免后5周抗體即可達(dá)到7.3log2;200μg質(zhì)粒大劑量進(jìn)行免疫后觀察14天,雞只狀態(tài)良好,無不良反應(yīng);30μg質(zhì)粒劑量進(jìn)行免疫兩次,連續(xù)監(jiān)測6個月,抗體效價平均為5.4log2。通過禽流感DNA疫苗和轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合免疫研究摸索,結(jié)果表明二者聯(lián)合免疫能提高禽流感抗體水平1.2個滴度,為禽流感DNA疫苗的臨床推廣應(yīng)用提供參考。
【圖文】：

圖 1.1 流感病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1.1 Particle structure of influenza virusB1、PB2、PA、HA、NA、NP 和 M1、M2 為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1、NS白。AIV 基因組 RNA 的復(fù)制和 AIV mRNA 轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵組分是由 PB2 三個亞基所構(gòu)成的復(fù)合酶的聚合體所調(diào)控的，因為它的保守異率又比較低，把該部位作為重點靶位已變?yōu)榭?AIV 藥物設(shè)計的。IV 粒子(圖 1.1) 的表面纖突是在囊膜下分布著，形態(tài)不一，在囊 HA 蛋白和 NA 蛋白兩種類型的表層纖突 (圖 1.1)，長為 10-14n棒狀，能凝集血紅細(xì)胞，NA 形狀像蘑菇樣。每個病毒粒子表面突起，都由 NA 和 HA 共同構(gòu)成，并且彼此均勻地在囊膜上分布[IV 粒子囊膜上還有一纖細(xì)的突起被稱作 M2 跨膜蛋白，M2 可以

據(jù)相關(guān)報道統(tǒng)計僅 2017 年第 1 季度全球就共計報告發(fā)生 1444 起 HPAI情，其中包含 740 多萬羽的易感禽，發(fā)病禽約 49 萬羽，病死禽 34 萬羽，禽近 680 萬羽，，其中我國發(fā)病禽約 16 萬羽，銷毀禽約 113 萬羽，造成了巨經(jīng)濟(jì)損失[64]。根據(jù)國際獸醫(yī)局（OIE）編寫的 2017 第 1 季度 HPAI 疫情報告來看，當(dāng) AIV 流行毒株比較復(fù)雜，所含有的 HPAI 病毒包括 H5N1、H5N2、H5N55N6、H5N8 和 H7N9 等 6 個亞型，其中以 H5N8 亞型最多，報告有 1258 起[62017 年從 OIE 網(wǎng)站(http://www.oie.int)查詢 2013 年至今世界范圍內(nèi) HPH5 和 H7 型）發(fā)病分布情況，不難看出我國自 2013 年 HPAI（H5 和 H7 型以前的局部的點發(fā)變?yōu)閷崟r性的發(fā)生（圖 1.2-圖 1.7）。隨著在檢測中情流毒的不斷變異，多地報道禽流感病毒感人的事件增加，就意味我國 HPAI的復(fù)雜性和控制難度更進(jìn)一步。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 李世釗;劉哲;楊會興;黃茗鑫;于正強;吳邦元;賴為民;;牛脾轉(zhuǎn)移因子對雛雞免疫功能的影響研究[J];核農(nóng)學(xué)報;2018年04期

2 任培森;胡春磊;唐榮宏;呂文靜;張秀媛;陳紅秀;付旭彬;丁壯;劉欣欣;;重組大腸桿菌DH5α-pCAGGoptiHA5培養(yǎng)基優(yōu)化及高密度培養(yǎng)[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2017年11期

3 任培森;呂文靜;唐榮宏;陳紅秀;張秀媛;胡春磊;付旭彬;丁壯;劉欣欣;;禽流感DNA疫苗和轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合免疫效果研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2017年21期

4 王占楠;劉晶;王棋;姚心茹;王成宇;胡譯文;楊桂連;姜延龍;王春鳳;;表達(dá)H9N2亞型禽流感病毒HA2蛋白的延遲裂解型沙門菌DNA疫苗載體的構(gòu)建[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2017年07期

5 杜建;蘭鄒然;劉祥;劉林青;張淼潔;付雯;翟新驗;;2017年第1季度全球禽流感疫情分析[J];中國動物檢疫;2017年06期

6 林丹;謝劍鋒;嚴(yán)延生;;H7N9禽流感及相關(guān)疫情分析評估[J];中國人獸共患病學(xué)報;2017年03期

7 田純見;羅瓊;高佳卉;林志雄;;中國高致病性禽流感疫情流行特征及其防控措施[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年05期

8 賴偉健;;禽流感的流行特點及防控措施[J];現(xiàn)代農(nóng)村科技;2017年02期

9 叢彥龍;鐘穎;孫藝學(xué);丁壯;;H9N2亞型禽流感病毒流行病學(xué)及其疫苗的研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2017年02期

10 陳煒;陳金強;魯君敏;馬衛(wèi)星;房英杰;朱彪;;3例人感染H7N9禽流感重癥病例臨床特征分析[J];預(yù)防醫(yī)學(xué);2016年10期

本文編號：2696233