【摘要】：弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種宿主廣泛的頂復(fù)門原蟲,不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,而且也嚴(yán)重威脅人的生命和健康。致密顆粒(Dense granule,GRA)是頂復(fù)門原蟲所特有的分泌器官,其分泌的致密顆粒蛋白具有調(diào)節(jié)信號(hào)通路、參與蟲體生長(zhǎng)、維持納蟲空泡和納蟲空泡膜的穩(wěn)定性等重要作用。本實(shí)驗(yàn)首先利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源性末端接合(NHEJ)技術(shù),對(duì)弓形蟲Ⅰ型RH蟲株的17種GRA基因(GRA11、GRA12 bis、GRA13、GRA14、GRA20、GRA21、GRA28-31、GRA33-38和GRA40)進(jìn)行敲除,然后觀察17種GRA缺失株的逸出能力、體外噬斑形成率和小鼠毒力,發(fā)現(xiàn)上述17種GRA基因缺失并不能對(duì)蟲株逸出能力、體外增殖速度和小鼠毒力產(chǎn)生影響。然后,通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組(HR)技術(shù),構(gòu)建了Ⅰ型RH和Π型Pru GRA12缺失蟲株及GRA12缺失回補(bǔ)蟲株,發(fā)現(xiàn)其在體外增殖和蟲斑形成率上與野生株并無顯著性差異,但在小鼠毒力方面,RHΔGRA12敲除蟲株感染小鼠可存活至21天,PruΔGRA12蟲株毒力明顯減弱,且形成的腦包囊數(shù)顯著減少,由此可以得出GRA12在Ⅰ型和Π型蟲株中是一種毒力基因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,ROP18也可以影響弓形蟲對(duì)小鼠的毒力作用,因此我們構(gòu)建了Ⅰ型蟲株ROP18基因缺失株,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行GRA12基因的敲除,成功構(gòu)建了RHΔROP18ΔGRA12雙缺失蟲株,并利用PCR擴(kuò)增和Western Blot驗(yàn)證ROP18和GRA12基因均被成功敲除。以RHΔROP18ΔGRA12雙缺失株感染C57BL/6小鼠,每只小鼠接種100個(gè)雙缺失株速殖子,結(jié)果顯示30 d內(nèi)小鼠未發(fā)生死亡,說明雙敲除兩種基因后弓形蟲毒力進(jìn)一步降低。待小鼠存活45 d后,再次感染RH野生株速殖子100個(gè),小鼠在30 d內(nèi)均未發(fā)生死亡,說明此劑量?jī)?nèi)的RHΔROP18ΔGRA12蟲株,可以對(duì)野生株RH的再次感染起到免疫保護(hù)作用,能作為一種弱毒疫苗候選蟲株。綜上所述,本研究共構(gòu)建了18種GRA基因敲除蟲株,闡明了其基本生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)17種GRA基因(GRA11、GRA12 bis、GRA13、GRA14、GRA20、GRA21、GRA28-31、GRA33-38和GRA40)缺失不影響弓形蟲的逸出、增殖及對(duì)小鼠的毒力;其中的GRA12雖然在Ⅰ型和Π型蟲株中不影響體外裂殖,但是明顯減弱弓形蟲的毒力。我們構(gòu)建了ROP18和GRA12雙敲除蟲株,發(fā)現(xiàn)RHΔROP18ΔGRA12蟲株可以顯著減弱弓形蟲對(duì)小鼠的毒力,具有作為一種弱毒疫苗的潛力,為研發(fā)抗弓形蟲疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

17圖 2.2 RNA 水平鑒定陽(yáng)性單克隆蟲株Figure 2.2 Identification of positive monoclonal strains in the RNAlevelMarker：Trans 2000 Plus DNAmarker實(shí)驗(yàn)

碩士學(xué)位論文 第二章 弓形蟲 GRA 基因缺失株篩選后的蟲株，進(jìn)行 25T HFF 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，提取 DNA 或 RNA用 PCR 驗(yàn)證敲除。結(jié)果顯示，RH 野生株均可以擴(kuò)增出大小為 22均未擴(kuò)增出條帶（圖 2.1 和圖 2.2）。說明 17 種 GRA 敲除蟲株均
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.72

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9 馮q，

本文編號(hào)：2695994