發(fā)布時間：2020-06-04 02:38

【摘要】：雞是重要的非哺乳類脊椎模式動物,已被廣泛用于發(fā)育生物學、病毒學和免疫學研究。由于雞具有天然的高血糖和胰島素抵抗的特性,使得雞成為了研究人類肥胖、胰島素抵抗和二型糖尿病的潛在動物模型。在現(xiàn)代肉雞產(chǎn)業(yè)中,肉雞的腹脂過度沉積給肉雞業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟和環(huán)境問題,已成為一個亟待解決的難題。要解決這個難題,就必需要了解雞的脂肪組織是如何形成的,即必須了解雞脂肪細胞的分化及其分子調(diào)控機制。目前,雞的永生化前脂肪細胞系至今尚未建立,導致雞的脂肪生成機制和肥胖癥發(fā)病機理研究滯后。本研究的目的是建立永生化的雞前脂肪細胞系,并揭示雞脂肪細胞分化過程中的基因表達規(guī)律。研究首次利用雞的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(chTERT)和雞的端粒酶RNA(chTR)重建了雞前脂肪細胞的端粒酶活性,并成功建立了兩個永生化的雞前脂肪細胞系。首先克隆了chTERT和chTR基因,構(gòu)建了這兩個基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLXRN-chTERT和pLPCX-chTR,分別與pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細胞,制備了相應的逆轉(zhuǎn)錄病毒。分離培養(yǎng)原代雞前脂肪細胞,采用單獨感染chTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒和聯(lián)合感染chTERT、chTR兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法,利用藥物篩選獲得了兩個永生化的雞前脂肪細胞系,同時證明了雞前脂肪細胞的端粒酶活性的限速成分是chTERT而不是chTR。研究將單獨感染chTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒的永生化雞前脂肪細胞系命名為immortalized chicken preadipocyte 1(ICP1),將聯(lián)合感染chTERT和chTR逆轉(zhuǎn)錄病毒的永生化雞前脂肪細胞系命名為immortalized chicken preadipocyte 2(ICP2)。細胞增殖特性分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞在體外累積群體倍增數(shù)(PDs)均超過了100,達到了永生化細胞的判定標準;細胞形態(tài)學和β-gal染色分析結(jié)果都表明,ICP1和ICP2保持了原代雞前脂肪細胞的基本形態(tài),并且沒有出現(xiàn)衰老表型;半定量RT-PCR和TRAP分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞高表達端粒酶基因,且具有極高的端粒酶活性;DNA倍體分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞是非整倍體;錨定不依賴性生長分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化;同工酶分析和PCR物種鑒定分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞是雞源細胞,并且排除其它細胞污染的可能性;分化特性分析結(jié)果表明,ICP1和ICP2細胞保持了原代雞前脂肪細胞的分化能力,其脂肪細胞分化標記基因的表達模式與原代雞前脂肪細胞相似。最后,應用Agilent雞全基因4×44K芯片,分析了雞前脂肪細胞系在整個分化過程中的基因表達譜,篩選出與雞脂肪細胞分化相關(guān)的差異基因,并進行了基因功能注釋和基因通路分析。本研究首次報道了通過單獨轉(zhuǎn)導chTERT或聯(lián)合轉(zhuǎn)導chTERT和chTR能夠重建雞的端粒酶活性,并成功建立了兩個永生化的雞前脂肪細胞系,同時利用細胞系開展了雞前脂肪細胞分化過程中的基因表達譜分析。所建立的永生化雞前脂肪細胞系為研究雞脂肪形成、脂類代謝、肥胖和相關(guān)疾病等提供了理想的體外細胞模型,研究結(jié)果同時為永生化其它類型的鳥類細胞提供了線索。雞前脂肪細胞分化過程中的表達譜分析結(jié)果為進一步揭示雞前脂肪細胞分化的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

位于中小染色體上，而與大染色體無關(guān)，并且均是在染色體的一端出現(xiàn)巨型端粒，而另一端含有正常大小的端粒。圖1-1 雞染色體的端粒序列圖譜[58]Fig.1-1 Telomeric sequence ideogram of chicken chromosomesO'Hare和Delany[75]比較了雞的正常細胞（來自UCD 001、ADOL Line 0）、永生化細胞（DF-1）和轉(zhuǎn)化細胞（DT40）間的端粒差異。發(fā)現(xiàn)來自這4種不同遺傳背景材料的細胞中，巨型端粒的數(shù)量和分布以及全部端粒序列在基因組中所占比例都存在顯著差異。有趣的是，基因組中端粒序列最多的是DF-1（一個非轉(zhuǎn)化的、永生化的、端粒酶陰性的雞胚胎成纖維細胞系）細胞，占基因組序列的17%，，與之相比，UCD 001雞占5%，DT40細胞占1.2%。究竟是什么原因?qū)е码u的端粒序列數(shù)量和差異如此之大目前還不清楚，推測這可能與雞的基因重組形式以及端粒的維持機制有關(guān)。巨型端粒的長度和分布在不同種類、不同個體（甚至在雞高度近交的家系中）、不同基因型的鳥類間是高度可變的[72,74-76]。Rodrigue等[76]的遺傳研究顯示，在雞近交系的同胞之間，巨型端粒表現(xiàn)出高度變異和不均一性

v-II、v-III、v-IV、1、2、A 、B'、C、D和E，以及端粒特有的“T”基序[99,100]（見圖1-2）。chTERT蛋白與人（human TERT, hTERT）和鼠（mouse TERT, mTERT）相比，相似性只有45%和41%，但是chTERT含有所有上述那些基序，它們分別是：v-（I1~196），v-I（I495~531），v-II（I554~588），v-IV（625~753），T基序（756~803）
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S831

【參考文獻】

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本文編號：2695763