【摘要】：化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一種能夠引起動(dòng)物化膿性感染的重要致病菌。耐抗生素T.pyogenes引起的感染性疾病療效下降已逐漸成為臨床治療的難題。MefA和MsrA外排泵是引起該菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要原因之一,研究外排泵抑制劑(EPI)對消減/逆轉(zhuǎn)該菌耐藥性具有重要意義。但目前已知的EPI如利血平等因其毒性大、副作用多等缺點(diǎn)不便應(yīng)用于臨床治療。因此,研發(fā)低毒高效的EPI成為治療耐藥T.pyogenes等細(xì)菌引起的感染性疾病的新策略。木犀草素是一種黃酮類化合物,具有抗菌、消炎、抗過敏和抗腫瘤等多種藥理活性,隨著對木犀草素抗菌活性研究的不斷深入,已有研究表明木犀草素具有抑制細(xì)菌外排泵、逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的作用。本研究通過PCR方法從本課題組前期鑒定的外排泵陽性T.pyogenes中擴(kuò)增得到mefA和msrA全基因序列,通過生物信息學(xué)技術(shù)分析擴(kuò)增得到的mefA和msrA全基因序列與其它菌株中該基因序列的同源性,預(yù)測這兩種蛋白的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞定位等信息,根據(jù)這些信息分析MefA和MsrA蛋白導(dǎo)致T.pyogenes耐藥的可能機(jī)制,在此基礎(chǔ)上根據(jù)預(yù)測的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)通過計(jì)算機(jī)輔助模擬木犀草素與外排蛋白的分子對接情況。結(jié)果顯示,mefA全基因序列與NCBI上已收錄序列的核苷酸序列同源率為89%~99%,氨基酸序列同源率為74%~97%,MefA蛋白為非分泌性疏水穩(wěn)定膜整合蛋白,在PDB數(shù)據(jù)庫中沒有模擬到與MefA蛋白同源率較高的三級結(jié)構(gòu);msrA全基因序列與NCBI上已收錄序列的核苷酸和氨基酸序列同源率均為99%~100%,MsrA蛋白為非分泌性親水穩(wěn)定蛋白,預(yù)測得到可靠的MsrA三級結(jié)構(gòu)模型,且木犀草素可以通過氫鍵作用力結(jié)合于MsrA蛋白分子上。采取微量肉湯稀釋法測定紅霉素、羅紅霉素、乙酰螺旋霉素、泰樂菌素、阿奇霉素、替米考星6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對木犀草素作用前后T.pyogenes的MIC值,比較MIC值的變化,篩選到木犀草素逆轉(zhuǎn)T.pyogenes耐藥性的最佳條件為1/2 MIC藥物濃度作用T.pyogenes 36 h。結(jié)果顯示,通過最佳逆轉(zhuǎn)條件作用后,6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對攜帶mefA和msrA基因的T.pyogenes的MIC值均不同程度下降,其耐藥性被逆轉(zhuǎn),而不攜帶外排基因菌株的MIC值未發(fā)生改變,提示木犀草素可能是通過抑制細(xì)菌對藥物的外排作用來逆轉(zhuǎn)T.pyogenes對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。利用DNAMAN軟件對木犀草素作用前后T.pyogenes的mefA和msrA全基因序列進(jìn)行比對分析,以檢測木犀草素對mefA和msrA基因序列的影響,并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測木犀草素對mefA、msrA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示,木犀草素對mefA和msrA基因核苷酸序列無影響;木犀草素能夠極顯著降低T.pyogenes msrA、mefA外排基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平,且大多數(shù)菌株的mefA和msrA基因mRNA表達(dá)水平下降程度與抗生素MIC值呈相同的下降趨勢,該結(jié)果與EPI利血平的作用結(jié)果一致,說明木犀草素可能是通過抑制T.pyogenes mefA和msrA外排基因的轉(zhuǎn)錄而影響其耐藥性。本文以大環(huán)內(nèi)酯類外排基因mefA和msrA為研究對象,通過預(yù)測其編碼的外排泵的結(jié)構(gòu)與功能等信息來分析其與T.pyogenes耐藥機(jī)制的關(guān)系,應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助模擬木犀草素與蛋白分子的對接情況,從而探討黃酮類化合物木犀草素的逆轉(zhuǎn)耐藥作用及其分子機(jī)制,將為抗耐藥菌靶標(biāo)藥物的篩選與研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

通過SWISS-MODEL 在線分析軟件預(yù)測T. pyogenes MefA和MsrA 外排泵的構(gòu)。用 Procheck 對蛋白模型進(jìn)行綜合評價(jià)。1.2.3 計(jì)算機(jī)輔助模擬木犀草素與化膿隱秘桿菌外排蛋白的分子對接應(yīng)用分子模擬軟件包 Syby 17.3 來生成木犀草素的初始結(jié)構(gòu)，用 triposGasteiger-marsili 電荷優(yōu)化分子的幾何結(jié)構(gòu)。用 AutoDock 4.2 軟件對 MsrA 與木犀行了分子對接。應(yīng)用拉馬克（LGA）遺傳算法來計(jì)算與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物分子的象。在對接過程中，最多考慮了化合物的 10 個(gè)構(gòu)象，取結(jié)合自由能最低的構(gòu)象行進(jìn)一步的分析。1.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析1.3.1 化膿隱秘桿菌 mefA 和 msrA 全基因序列 PCR 擴(kuò)增結(jié)果以 T. pyogenes 分離株基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 T. pyogenes 的 mefA全基因序列，經(jīng) 1.0%瓊脂糖電泳分析，，符合試驗(yàn)要求，結(jié)果見圖 1-1 和圖 1-2。M 2M 1 21

通過SWISS-MODEL 在線分析軟件預(yù)測T. pyogenes MefA和MsrA 外排泵的構(gòu)。用 Procheck 對蛋白模型進(jìn)行綜合評價(jià)。1.2.3 計(jì)算機(jī)輔助模擬木犀草素與化膿隱秘桿菌外排蛋白的分子對接應(yīng)用分子模擬軟件包 Syby 17.3 來生成木犀草素的初始結(jié)構(gòu)，用 triposGasteiger-marsili 電荷優(yōu)化分子的幾何結(jié)構(gòu)。用 AutoDock 4.2 軟件對 MsrA 與木犀行了分子對接。應(yīng)用拉馬克（LGA）遺傳算法來計(jì)算與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物分子的象。在對接過程中，最多考慮了化合物的 10 個(gè)構(gòu)象，取結(jié)合自由能最低的構(gòu)象行進(jìn)一步的分析。1.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析1.3.1 化膿隱秘桿菌 mefA 和 msrA 全基因序列 PCR 擴(kuò)增結(jié)果以 T. pyogenes 分離株基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 T. pyogenes 的 mefA全基因序列，經(jīng) 1.0%瓊脂糖電泳分析，符合試驗(yàn)要求，結(jié)果見圖 1-1 和圖 1-2。M 2M 1 21
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2694500