【摘要】：肉雞在集約化養(yǎng)殖模式下存在一系列免疫和應(yīng)激問題,尤其在肉雞養(yǎng)殖前期,各種疫病的發(fā)生率高且危害大,這與肉雞年齡階段性的免疫功能特性有關(guān)。基于此,我們針對(duì)性的選取黃芪多糖(Astragalus Polysacchirides,APS)作為免疫營養(yǎng)調(diào)控因子,結(jié)合營養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控策略,利用APS改變父母代種公雞腸道中的免疫微環(huán)境,經(jīng)長(zhǎng)期刺激后研究其免疫相關(guān)傳代性調(diào)控效應(yīng)及其營養(yǎng)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,并分析APS在體外試驗(yàn)中的免疫調(diào)節(jié)作用及相關(guān)信號(hào)通路因子,探討采用APS誘導(dǎo)的父系傳代免疫調(diào)控效應(yīng)應(yīng)對(duì)肉雞前期免疫性能低下問題的可行性。試驗(yàn)一、種公雞胸腺免疫的年齡階段差異性本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),120只1日齡科寶500種公雞,分為15籠飼喂,每籠8只雞,用以分析種公雞胸腺免疫性能的年齡階段差異性。在2周齡(雛雞)和40周齡(成年雞),每籠選取一只接近平均體重的種公雞進(jìn)行屠宰試驗(yàn),采集胸腺樣品進(jìn)行表型分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,并對(duì)核心調(diào)控因子的啟動(dòng)子甲基化修飾進(jìn)行檢驗(yàn),以解釋胸腺免疫功能的年齡階段差異性及其維持機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果顯示:成年雞的胸腺質(zhì)量和形態(tài)與雛雞存在顯著差異(P≤0.05);鑒于這種表型差異性,本試驗(yàn)采用RNA-seq方法分析了胸腺中基因在轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)狀況,用以確定年齡相關(guān)免疫功能差異的分子調(diào)控機(jī)理,Pearson相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)果均顯示成年雞和雛雞胸腺中基因在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達(dá)模式存在顯著差異,雛雞和成年雞間有1949個(gè)差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs,其中成年雞胸腺中有1822個(gè)高表達(dá)基因,127個(gè)低表達(dá)基因)。基于DEGs的GO和KEGG功能富集性分析結(jié)果篩選獲得4個(gè)免疫相關(guān)顯著富集性KEGG信號(hào)通路,分別為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作通路、腸道Ig A合成免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、Toll樣受體信號(hào)通路和糖尿病并發(fā)癥相關(guān)通路,這就說明肉雞胸腺免疫功能,包括抗原識(shí)別、炎癥反應(yīng)及腸道黏膜免疫等均具有發(fā)育階段差異性。與這4條免疫相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因在雛雞組均顯示低表達(dá)(P≤0.05)特性,說明2-W雛雞胸腺中4條免疫相關(guān)信號(hào)通路均呈現(xiàn)低活性狀態(tài)。肉雞胸腺免疫的年齡階段性差異可維持較長(zhǎng)時(shí)間,DNA甲基化修飾可滿足這一基因表達(dá)調(diào)控特性,所以我們檢驗(yàn)了CD40啟動(dòng)子甲基化修飾狀況,CD40與4條免疫信號(hào)通路的3條具有高相關(guān)性,且與胸腺免疫功能調(diào)控緊密相關(guān),且雛雞胸腺中的CD40啟動(dòng)子甲基化修飾水平極顯著(P≤0.01)高于成年雞,這與基因的表達(dá)差異性一致,維持基因在雛雞階段的低表達(dá)特性和相關(guān)通路的低活性。本試驗(yàn)說明肉雞胸腺免疫功能具有年齡階段差異性,相比于成年雞,雛雞的胸腺免疫處于一種低活性狀態(tài),此調(diào)控效應(yīng)與雛雞胸腺中CD40啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)的基因表達(dá)抑制存在一定相關(guān)性。試驗(yàn)二、飼糧添加黃芪多糖對(duì)種公雞免疫性能的影響肉雞發(fā)育前期胸腺TLR信號(hào)通路保持低活性狀態(tài),影響其免疫功能狀態(tài),而APS可適度激活TLR4信號(hào)通路,優(yōu)化機(jī)體免疫活性狀態(tài),本試驗(yàn)擬探索種公雞長(zhǎng)期攝入APS對(duì)其免疫和生產(chǎn)性能的影響。我們檢測(cè)了飼糧長(zhǎng)期(40周)添加APS對(duì)種公雞體重、腸道黏膜組織形態(tài)、血清細(xì)胞因子、腸道黏膜及脾臟免疫的影響。本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),160只科寶500種公雞隨機(jī)分為5組,在其玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中分別飼喂0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每個(gè)處理4重復(fù),每個(gè)重復(fù)8只雞,將種公雞飼喂至44周齡,稱量種公雞體重并采集血清樣品,左側(cè)頸靜脈放血屠宰后采集各小腸腸段、小腸黏膜和脾臟樣品進(jìn)行試驗(yàn)分析。我們之前的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于種公雞飼養(yǎng)過程中需要嚴(yán)格限飼,飼糧中添加APS對(duì)種公雞體重并無顯著影響,但飼糧添加10.00 g/kg APS可顯著改善種公雞腸道黏膜組織形態(tài)(后續(xù)分子指標(biāo)分析選取10.00g/kg APS處理組),腸道黏膜更新需依賴于APS的免疫刺激作用。所以,本試驗(yàn)首先采用抑菌環(huán)和梯度稀釋法試檢驗(yàn)了APS的直接抑菌效應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果顯示APS并無直接抑菌效應(yīng),APS免疫調(diào)節(jié)作用更多源自于其對(duì)免疫系統(tǒng)的直接影響,進(jìn)而我們分析了APS對(duì)腸道黏膜和脾臟免疫的影響。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS對(duì)空腸黏膜中TLR4信號(hào)通路、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素耐受及腸道組織形態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)均無顯著影響;血清中細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β和IL-4濃度亦無顯著差異性;種公雞脾臟中,飼糧添加APS對(duì)TLR4相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄亦無系統(tǒng)性影響�？傊�,種公雞飼糧中添加10.00 g/kg APS可顯著改善其腸道黏膜組織形態(tài),但源于種公雞免疫系統(tǒng)對(duì)飼糧中長(zhǎng)期(44周)添加APS的適應(yīng)性,APS對(duì)種公雞空腸黏膜及脾臟免疫功能均無顯著影響。試驗(yàn)三、種公雞飼糧添加黃芪多糖對(duì)商品代肉雞免疫的影響由于種公雞免疫系統(tǒng)對(duì)APS長(zhǎng)期刺激的適應(yīng)性,種公雞日糧添加APS對(duì)其本身腸道黏膜和脾臟免疫并無顯著影響,本試驗(yàn)旨在探討種公雞飼糧添加APS對(duì)商品代肉雞生長(zhǎng)狀況和免疫性能的傳代調(diào)控作用。本研究采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),在基礎(chǔ)日糧中分別添加0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每個(gè)處理4重復(fù),每個(gè)重復(fù)8只雞,將種公雞飼喂至40周齡后每個(gè)重復(fù)選取一只高繁種公雞采集精液,并分別為每個(gè)重復(fù)對(duì)應(yīng)的12只種母雞輸精,在5天里連續(xù)3次輸精后采集種蛋,每個(gè)重復(fù)選取重量在65到70 g之間的受精蛋20枚用于孵化試驗(yàn)以獲得商品代肉仔雞,每個(gè)重復(fù)獲得16只商品代肉雞,商品代肉雞根據(jù)種公雞處理進(jìn)行分組,商品代肉雞飼喂商品顆粒料,不額外添加APS,自由飲水,飼喂于環(huán)控倉中且不進(jìn)行疫苗免疫,商品代肉雞飼喂至2周齡(采集每天體重?cái)?shù)據(jù))時(shí)左側(cè)頸靜脈放血屠宰后采集血清、小腸腸段、小腸黏膜和脾臟樣品。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS可傳代性的改善商品代肉雞養(yǎng)殖前期的體重和空腸黏膜組織形態(tài),基于此表型差異性,選取10.00 g/kg APS處理組進(jìn)行進(jìn)一步的分子檢驗(yàn);種公雞飼糧APS可誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號(hào)通路產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受樣反應(yīng)狀態(tài),APS對(duì)TLR4表達(dá)無影響,TLR4信號(hào)通路下游TRIF通路激活而My D88信號(hào)通路保持相對(duì)靜息狀態(tài),NF-κB表達(dá)顯著(P≤0.05)提高,種公雞飼糧添加APS顯著(P≤0.05)提高了IFN-α和IFN-β的表達(dá),趨勢(shì)性(0.05≤P≤0.1)提高了IL-4和IL-6的表達(dá),并顯著(P≤0.05)提高了IL-4上游調(diào)控因子GATA3的表達(dá),內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子SOCS1的表達(dá)極顯著(P≤0.01)升高,IFN-α下游的STAT1表達(dá)顯著(P≤0.05)升高,總之,種公雞飼糧添加10.00g/kg APS可通過活化TLR4下游的TRIF通過,并活化IFN-α/β及其下游的內(nèi)毒素耐受因子SOCS1,誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號(hào)通路的內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng);腸道黏膜免疫活性可通過血液循環(huán)系統(tǒng)影響系統(tǒng)免疫活性,種公雞飼糧添加10.00 g/kg APS可顯著(P≤0.05)提高商品代肉雞血清I類干擾素(IFN-α和IFN-β)水平;進(jìn)一步分析APS對(duì)脾臟免疫的父系傳代調(diào)控作用,與腸道黏膜免疫系統(tǒng)類型,種公雞飼糧APS可影響商品代肉雞脾臟中的TLR4信號(hào)通路活性,誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng),其下游通路My D88通路抑制,而TRIF通路被激活,種公雞飼糧中添加APS對(duì)商品代肉雞脾臟中細(xì)胞因子的表達(dá)亦有顯著影響,可顯著(P≤0.05)提高TNF-α和IL-6的表達(dá),并可顯著(P≤0.05)提高IL-4及其上游調(diào)控因子GATA3的表達(dá),但促炎細(xì)胞因子和內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子的表達(dá)均無顯著變化。總之,本試驗(yàn)說明種公雞飼糧中長(zhǎng)期添加高劑量APS可誘導(dǎo)商品代肉雞空腸黏膜和脾臟免疫的TLR4信號(hào)通路內(nèi)毒素耐受免疫反應(yīng),并可通過其免疫調(diào)控效應(yīng)改善商品代肉雞的腸道黏膜組織形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。試驗(yàn)四、黃芪多糖對(duì)腸上皮細(xì)胞TLR4信號(hào)通路活性的影響TLR信號(hào)通路是最重要的免疫識(shí)別信號(hào)通路,基于試驗(yàn)一,我們發(fā)現(xiàn)雛雞胸腺TLR4信號(hào)通路處于抑制狀態(tài),所以本論文擬采用APS針對(duì)性的適度激活TLR4通路,來改善肉雞免疫性能。試驗(yàn)二、三結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS可通過父系傳代調(diào)控作用改善商品代肉雞的腸道黏膜免疫性能,進(jìn)而通過血液循環(huán)系統(tǒng)影響脾臟免疫功能。本試驗(yàn)選用Caco2細(xì)胞作為腸道上皮細(xì)胞模型,并構(gòu)建LPS內(nèi)毒素耐受免疫模型,結(jié)合LPS炎癥反應(yīng)模型,探討APS對(duì)腸道上皮細(xì)胞免疫狀態(tài)的影響,并通過RNA干擾在轉(zhuǎn)錄水平抑制TRIF通路活性,分析APS免疫反應(yīng)類型及其相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控因子。試驗(yàn)第一部分采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),分為5組,對(duì)照組(C),APS處理組(APS,1mg/m L),LPS處理組(LPS,1 ug/m L),APS+LPS組(AL)及LPS內(nèi)毒素耐受組(ET),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采用q RT-PCR和流式細(xì)胞分析方法分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢驗(yàn)TLR4信號(hào)通路、細(xì)胞因子及內(nèi)毒素耐受調(diào)控因子相關(guān)基因的表達(dá)狀況,并采用ELISA試劑盒檢驗(yàn)Caco2細(xì)胞IL-1、IL-8及TNF-α的合成和分泌活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示LPS刺激可誘導(dǎo)TLR4-My D88相關(guān)炎性細(xì)胞毒性反應(yīng),活化TLR4信號(hào)通路,并顯著(P≤0.05)提高促炎細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)(P≤0.05)IL-8的合成和分泌活性,而APS可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),顯著(P≤0.05)降低IL-8的合成和分泌,產(chǎn)生類似于內(nèi)毒素耐受反應(yīng)的基因表達(dá)特性。第二部分試驗(yàn)采用2×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì),兩個(gè)處理因素分別為TRIF干擾和APS及LPS處理,分別為(對(duì)照組、TRIF干擾組)×(對(duì)照組、LPS處理組、APS+LPS處理組),分別為對(duì)照組(Control)、LPS處理組(LPS)、APS+LPS處理組(AL)以及TRIF干擾組對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(s-Control)、LPS處理組(s-LPS)和APS+LPS處理組(s-AL),每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分析TRIF抑制狀況下APS和LPS刺激對(duì)Caco2細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果顯示TRIF敲除后,APS不能有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),TLR信號(hào)通路活性及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)均表現(xiàn)出與LPS處理組高度的一致性,促炎細(xì)胞因子IL-8仍保持較高的合成和分泌活性。綜上,在Caco2細(xì)胞模型中,APS可TRIF依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞毒性反應(yīng),并顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子高表達(dá),進(jìn)一步可確定APS可影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)的活性狀態(tài),從側(cè)面驗(yàn)證說明APS的父系傳代調(diào)控效應(yīng)是源于其對(duì)腸道黏膜免疫的影響。試驗(yàn)五、黃芪多糖父系傳代性調(diào)控效應(yīng)中的表觀遺傳修飾作用本試驗(yàn)采集APS父系傳代試驗(yàn)中對(duì)照組和10.00 g/kg APS處理組種公雞空腸黏膜、脾臟及精液樣品,和商品代肉雞空腸黏膜和脾臟樣品,并檢驗(yàn)其關(guān)鍵調(diào)控因子My D88、TRIF和SOCS1的啟動(dòng)子甲基化和組蛋白修飾狀況,用以探討APS以精子為媒介的營養(yǎng)表觀遺傳修飾作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示就DNA甲基化修飾而言,種公雞飼糧APS可顯著(P≤0.05)降低種公雞空腸黏膜和精子中的的SOCS1啟動(dòng)子甲基化修飾水平,商品代肉雞空腸黏膜中的SOCS1啟動(dòng)子甲基化也有一定程度的降低,且SOCS1啟動(dòng)子Cp G富集區(qū)段為轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合區(qū),APS誘導(dǎo)的低甲基化有利于促進(jìn)SOCS1的表達(dá),且精子中SOCS1啟動(dòng)子的低甲基化可作為傳代調(diào)控因子參與APS的父系傳代調(diào)控效應(yīng);APS對(duì)My D88、TRIF及脾臟中SOCS1的啟動(dòng)子甲基化修飾并無顯著影響,只有組織特異性的低甲基化修飾;種公雞飼糧中的APS可顯著(P≤0.05)影響空腸黏膜和脾臟中My D88和TRIF基因啟動(dòng)子區(qū)段的組蛋白修飾(脾臟SOCS1啟動(dòng)子Dimethyl-H3K9修飾亦有顯著提高),誘導(dǎo)符合基因表達(dá)特性的組蛋白修飾類型。另外,種公雞飼糧添加APS可顯著提高(P≤0.05)精子中My D88的Dimethyl-H3K9修飾水平,并可顯著(P≤0.05)降低精子中TRIF的Dimethyl-H3K9修飾水平�？傊�,在APS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受樣父系傳代調(diào)控過程中,DNA甲基化(空腸黏膜SOCS1)和組蛋白修飾(My D88和TRIF)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)結(jié)論:肉雞雛雞階段的系統(tǒng)免疫活性處于相對(duì)抑制狀態(tài),而APS可誘導(dǎo)TLR4-TRIF通路相關(guān)內(nèi)毒素耐受樣免疫反應(yīng),可針對(duì)性改善肉雛雞免疫性能,通過種公雞飼糧添加APS可通過父系營養(yǎng)表觀遺傳機(jī)制傳代誘導(dǎo)商品代肉雞腸道黏膜免疫系統(tǒng)TLR4信號(hào)通路的內(nèi)毒素耐受免疫反應(yīng),并影響外周免疫器官脾臟的免疫狀態(tài),進(jìn)而可優(yōu)化肉仔雞前期的腸道形態(tài)和生長(zhǎng)狀況,在肉仔雞獲得期望性狀。總之,APS通過父系營養(yǎng)表觀遺傳機(jī)制改善商品代肉雞免疫和體增重是一種應(yīng)對(duì)肉雞雛雞階段免疫抑制問題的可行性策略。
【圖文】：

本研究的技術(shù)路線

40 周齡成年雞的胸腺質(zhì)量極顯著高于（P ≤ 0.01）2 周齡雛雞（圖2-1A，但成年雞的胸腺指數(shù)極顯著（P ≤ 0.01）低于雛雞（圖 2-1C）。另外，成年雞與雛雞胸腺外觀形態(tài)有顯著差異，雛雞胸腺更加圓潤，，相比于雛雞，成年雞的胸腺更加細(xì)長(zhǎng)平薄（圖 2-1B）。種公雞胸腺質(zhì)量和形態(tài)在雛雞和成年雞間存在顯著差異性。圖 2-1 種公雞胸腺質(zhì)量和表型Figure 2-1 Weight and morphology of thymus in breeder cocks
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831.5


本文編號(hào)：2693208