【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種危害性較大的豬傳染病,每年給我國畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)病死豬剖檢常�？梢姺尾砍霈F(xiàn)彌漫性間質(zhì)性肺炎并伴有大量出血點(diǎn)。但是PRRSV感染豬肺損傷的分子機(jī)制卻尚不清楚。最近的研究表明,在PRRSV感染7天后的炎癥期豬的支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加。中性粒細(xì)胞是重要的先天免疫細(xì)胞,在非特異性免疫系統(tǒng)中起著十分關(guān)鍵的作用,但是過多中性粒細(xì)胞在肺部的募集可能造成肺損傷。為了探明中性粒細(xì)胞在PRRSV感染豬肺中募集的分子機(jī)制以及確認(rèn)病毒感染導(dǎo)致肺損傷的生物標(biāo)記物,本研究一部分工作收集了一批人工攻毒的豬肺以及臨床自然感染的豬肺,并對(duì)一些與中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)的分子以及髓過氧化物酶(MPO)的活性進(jìn)行了檢測。這部分工作對(duì)探索PRRSV感染是如何導(dǎo)致肺損傷具有重要意義。但是,由于豬等大型動(dòng)物不易像小鼠一樣進(jìn)行單個(gè)基因的敲除,也不適用于小批量生物試劑的干擾應(yīng)用,比如使用抗體或者siRNA來中和或者耗竭掉某個(gè)細(xì)胞因子或蛋白,所以無法更深入的研究PRRSV感染的分子機(jī)理。因此第二部分工作主要是在免疫缺陷小鼠上構(gòu)建移植豬肺的PRRSV感染模型,這部分工作將對(duì)后續(xù)進(jìn)一步深入研究PRRSV感染導(dǎo)致肺損傷的分子機(jī)理提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.中性粒細(xì)胞在PRRSV感染豬肺中募集首先,PRRSV感染顯著激活炎癥因子的mRNA表達(dá);蘇木精伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)無論是人工攻毒還是自然感染樣本都存在著顯著的間質(zhì)性肺炎、肺泡隔增厚并伴隨著大量炎性細(xì)胞的浸潤等組織病變,diff-quik染色以及免疫組化的方法證實(shí)在這些炎性細(xì)胞中有大量的中性粒細(xì)胞,并且通過熒光定量PCR(qPCR)以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)或免疫印跡(Western blot)的方法檢測發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞釋放的標(biāo)志性酶類MPO以及其趨化因子IL-8的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào);與中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移相關(guān)的黏附因子VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而ICAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)在人工攻毒組中微微下調(diào),在自然感染組中顯著增加,以上結(jié)果表明中性粒細(xì)胞在PRRSV感染豬肺中募集。另一方面,調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞分化的IL-23→IL-17A→G-CSF軸的mRNA表達(dá)顯著上調(diào),說明PRRSV感染促使中性粒細(xì)胞源源不斷的分化成熟進(jìn)入血液中,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。2.移植豬肺PRRSV感染模型的構(gòu)建利用免疫缺陷小鼠,將剛出生仔豬的豬肺移植到小鼠腎包膜下。移植手術(shù)過后7天和14天,移植物的面積和體積有顯著的增加,HE染色顯示移植的肺組織保留了正常豬肺組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu),說明移植物在小鼠腎包膜下正常生長。接下來本研究選擇了三種方式對(duì)移植的豬肺組織進(jìn)行PRRSV攻毒。感染兩周后,無論是腹腔注射組、手術(shù)注射組、尾靜脈注射組都能夠通過qPCR檢測到PRRSV,HE染色顯示三種攻毒方式豬肺組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生病理學(xué)改變,免疫組化和免疫熒光也檢測到顯著的PRRSV陽性信號(hào),并且炎癥相關(guān)因子IL-6以及CXCR3的mRNA表達(dá)顯著上調(diào),以上結(jié)果表明移植豬肺PRRSV感染模型構(gòu)建成功。最后利用該感染模型在體內(nèi)注射CXCR3的拮抗劑AMG487發(fā)現(xiàn)用藥過后PRRSV感染受到了顯著的抑制,HE染色顯示肺組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)有了明顯的好轉(zhuǎn),而免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示幾乎沒有或者只有少量的PRRSV陽性信號(hào),說明AMG487能夠明顯抑制PRRSV的感染,減緩豬肺的損傷,以上結(jié)果證明該模型可以用來篩選和驗(yàn)證治療PRRSV感染的藥物。綜上,本研究結(jié)果表明,PRRSV感染后顯著激活炎癥因子的表達(dá),組織學(xué)試驗(yàn)和MPO活性試驗(yàn)證實(shí)了中性粒細(xì)胞在PRRSV感染豬肺中募集,VCAM-1和IL-8的聯(lián)合表達(dá)可以作為病毒感染誘導(dǎo)肺損傷的潛在生物標(biāo)記物,而中性粒細(xì)胞過度募集導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是PRRSV感染豬肺損傷的一個(gè)重要因素。本研究還創(chuàng)新型的構(gòu)建了一種免疫缺陷小鼠腎包膜下移植豬肺的模型,并利用該模型成功感染PRRSV,在此基礎(chǔ)上藥物注射AMG487成功的抑制了PRRSV在移植的豬肺組織中的感染,減緩了肺損傷,證明該模型切實(shí)可行用于一些小分子化合物在豬呼吸系統(tǒng)疾病的研究,從而為能夠更好的深入到分子致病機(jī)理研究豬的呼吸系統(tǒng)疾病開辟了一條新的途徑。
【圖文】：

chen 2009)），從而使中性粒細(xì)胞變形能力減弱，更易于黏附于血管內(nèi)皮細(xì)erschuk et al 1999；Halbwachs and Lesavre 2012)（圖 1-2）。這一過程是一個(gè)理過程，是在多種因子的共同介導(dǎo)下完成的，包括：①.捕獲/扣押；②.滾附；④.移出(Ley et al 2007；Schmidt et al 2011)四個(gè)步驟。首先，在 IL-1、炎癥因子的作用下內(nèi)皮細(xì)胞被激活，，位于其胞漿顆粒中的 P-選擇素迅速易表面捕獲中性粒細(xì)胞，隨后內(nèi)皮細(xì)胞表面 P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素性粒細(xì)胞表面的選擇素配體 PSGL-1、L-選擇素等黏附因子發(fā)生相互作用性粒細(xì)胞的緩慢滾動(dòng)和松馳黏附 (Ley 2003；Ware 2006)。接著中性粒細(xì)胞子 IL-8 激活，其上的β2-整合素迅速易位到細(xì)胞表面，并與內(nèi)皮細(xì)胞表M-1、VCAM-1 發(fā)生相互作用形成緊密黏附 (Muller 2011；Nourshargh and)。最后活化的中性粒細(xì)胞在黏附因子 ICAM-1、VCAM-1、血小板內(nèi)皮細(xì)子PECAM-1 以及趨化因子IL-8等的共同介導(dǎo)下, 通過旁細(xì)胞途徑和跨細(xì)越內(nèi)皮細(xì)胞層移出到肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi) (Dolinay et al 2012；Kvietys and S；Zen and Parkos 2005)（圖 1-3）。

圖 1-2 中性粒細(xì)胞在肺部的募集（2011，Jochen Grommes）Fig.1-2 Recruitment of neutrophils into the lung圖 1-3 中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移Fig.1-3 Neutrophil trans-endothelial migration
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692875