【摘要】：氨基酸是生命體中最為重要的有機(jī)小分子,有研究發(fā)現(xiàn),它可作為乳蛋白質(zhì)合成的原材料促進(jìn)乳蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成,不僅僅如此氨基酸還能夠作為信號(hào)分子激活細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控酶類,如磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinas,PI3K)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)等調(diào)控細(xì)胞內(nèi)乳蛋白和乳脂肪的合成~([1,2,3,4])。近年來(lái),有文獻(xiàn)報(bào)道氨基酸作為信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞生理功能的調(diào)控可能是由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的,然而其分子機(jī)制現(xiàn)在還不夠清楚和深入,而氨基酸調(diào)控乳蛋白乳脂肪和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體之間的關(guān)系更是知之甚少。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(amino acid transporter)是位于質(zhì)膜上溶脂載體蛋白,它能夠?qū)⒂坞x在細(xì)胞外的氨基酸主動(dòng)吸收運(yùn)轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi),或者將胞漿內(nèi)的氨基酸轉(zhuǎn)出細(xì)胞~([5,6,7])。本研究意圖揭示鈉離子依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(the sodium-dependent neutral amino acid transporter 2,SNAT2/SLC38A2)在體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BEMCs)調(diào)節(jié)乳蛋白乳脂肪合成中的功能及影響氨基酸調(diào)節(jié)乳合成的分子機(jī)理,為進(jìn)一步研究奶牛泌乳調(diào)控代謝合成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)利用奶牛乳腺組織原代培養(yǎng)細(xì)胞法獲得和培養(yǎng)BEMCs,免疫熒光染色檢測(cè)BEMCs中角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)表達(dá)以鑒定細(xì)胞類別和純度、蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)檢測(cè)β酪蛋白(β-casein)驗(yàn)證細(xì)胞的類別及其泌乳能力;用和β-casein及細(xì)胞培養(yǎng)液上清甘油三酯含量表示細(xì)胞乳蛋白乳脂肪合成能力及分泌能力,建立BEMCs泌乳模型;添加3種終濃度為0.6mmol/L的氨基酸(Met、Lys、Leu)處理BMECs 24h,通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)、Western blotting技術(shù)和甘油三脂試劑盒檢測(cè)SNAT2、酪蛋白(β-casein)基因的表達(dá)量和BEMC培養(yǎng)液上清甘油三酯的分泌量;將N-flag-SNAT2真核表達(dá)載體以及SNAT2siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,進(jìn)行SNAT2基因的過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Western blotting和甘油三脂試劑盒分別檢測(cè)SNAT2、mTOR/p-mTOR、Akt/p-Akt、β酪蛋白(β-casein)蛋白表達(dá)量和BEMCs培養(yǎng)液上清的甘油三酯含量;添加不同濃度的Met處理BEMCs 24后,收集細(xì)胞總蛋白,利用Western blotting篩選出Met對(duì)SNAT2最佳作用濃度;向Met處理的BEMCs中轉(zhuǎn)入SNAT2 si-RNA,對(duì)照為Met+陰性RNA(negative control,NC),24h后收細(xì)胞總蛋白通過(guò)Western blotting檢測(cè)樣品蛋白里的SNAT2、mTOR/p-mTOR和Akt/p-Akt含量;向0.4mmol/L的Wortmannin處理的BEMCs中轉(zhuǎn)入N-flag-SNAT2真核表達(dá)載體,對(duì)照設(shè)為空載體和Wortmannin+空載體,培養(yǎng)24后收細(xì)胞蛋白樣,Western blotting檢測(cè)SNAT2、mTOR/p-mTOR和Akt/p-Akt含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所獲取的BEMCs免疫熒光檢測(cè)CK18為陽(yáng)性,且western blotting檢測(cè)出β-caein;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種氨基酸(Met、Lys、Leu)均能顯著增加BMEC分泌乳蛋白和乳脂肪,并激活mTOR信號(hào)途徑,其中Met、Lys還能夠顯著上調(diào)SNAT2基因表達(dá);SNAT2能夠正向調(diào)節(jié)BMEC乳蛋白和乳脂肪的合成,并且激活PI3K-Akt和mTOR信號(hào)通路;敲低SNAT2后,蛋氨酸促進(jìn)BEMCs乳蛋白乳脂肪合成的功能顯著減弱,mTOR和PI3K-Akt信號(hào)途徑被抑制;過(guò)表達(dá)SNAT2,添加Wortmannin,阻斷PI3K-Akt途徑,與對(duì)照組相比,mTOR、PI3K-Akt途徑均被抑制,SNAT2過(guò)表達(dá)效應(yīng)消失。說(shuō)明mTOR途徑活性和SNAT2的表達(dá)受到PI3K-Akt途徑的正向調(diào)控。綜上,可得出以下結(jié)論:SNAT2正向調(diào)節(jié)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白乳脂肪合成;SNAT2通過(guò)PI3K-mTOR途徑調(diào)節(jié)乳合成;SNAT2介導(dǎo)氨基酸激活PI3K-mTOR信號(hào)途徑。本研究為揭示SNAT2調(diào)節(jié)乳合成的作用機(jī)理及氨基酸調(diào)節(jié)乳合成信號(hào)通路提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 the structure of amino acid transporter schematic diagram酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制運(yùn)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，主要可分為 2 種方式。協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和單向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制又被稱之為反向協(xié)同交換，主要指氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在向細(xì)胞內(nèi)它也向胞外運(yùn)別的氨基酸，完成氨基酸在細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移交換[86]。對(duì)總體氨基酸濃度仍然未發(fā)生變化。由于細(xì)胞內(nèi)非必須氨基酸可以通過(guò)自這種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可以向細(xì)胞內(nèi)“交換”必需氨基酸。細(xì)胞利用這種轉(zhuǎn)運(yùn)方壓的穩(wěn)定，更好的保障了細(xì)胞的生存生長(zhǎng)。單向協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)處于細(xì)胞氨依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制細(xì)胞內(nèi)的氨基酸濃度通�？偸歉哂诩�(xì)胞外，因此氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是穿過(guò)細(xì)胞膜。Na+依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，如 SNAT2，在轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸時(shí)

分析 的獲取及其培養(yǎng)純化組織塊法培養(yǎng)獲得了含有其他細(xì)胞，，主要是成纖維細(xì)胞，的養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感性不同，而貼壁的牛乳腺上皮細(xì)胞，利用這個(gè)特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)不斷純化了奶牛乳腺上皮細(xì)胞。圖養(yǎng) 7d 時(shí)，已經(jīng)有成纖維細(xì)胞爬出；培養(yǎng) 15d 時(shí)，乳腺上皮細(xì)養(yǎng)瓶里的乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合生長(zhǎng)（圖 3-1B）；底的時(shí)，用 5mL 移液槍緩慢吹勻小組織塊，并用緩沖液輕入 250μL 胰酶在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待成纖維細(xì)胞形狀加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化作用并棄去消化下的成纖維細(xì)胞，，反復(fù) 3 次純化后即可得到相對(duì)純凈 BEMCs（圖 3-1D）。呈卵石型形且色澤深；而成纖維細(xì)胞則呈長(zhǎng)條型，纖維狀且
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 徐柏林;精氨酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響及其調(diào)控機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2685999