【摘要】：羊口瘡(ORF)的快速診斷對(duì)于該病的防控至關(guān)重要,而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)可以滿足對(duì)羊口瘡病毒(ORFV)高效性的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。本試驗(yàn)對(duì)ORFVVIR基因擴(kuò)增,通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,對(duì)LAMP檢測(cè)ORFV進(jìn)行了顯色反應(yīng)、特異性和靈敏性的檢測(cè),并進(jìn)行了后續(xù)的臨床檢測(cè)。結(jié)果顯示,利用優(yōu)化的LAMP染色法,將呈現(xiàn)綠色的陽(yáng)性組與橙色的陰性組區(qū)分開(kāi)。對(duì)擴(kuò)增的質(zhì)粒和陽(yáng)性對(duì)照樣品的檢測(cè)呈現(xiàn)出了陽(yáng)性條帶,而對(duì)山羊痘、綿羊痘、牛傳染性鼻氣管炎和牛副流感3型病毒的檢測(cè)并無(wú)陽(yáng)性條帶。優(yōu)化的LAMP檢測(cè)ORFV的靈敏度比傳統(tǒng)PCR高出1 000倍。對(duì)15份臨床樣品檢測(cè)的結(jié)果表明,優(yōu)化的LAMP電泳和染色法對(duì)ORFV的檢出率均為100%,與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明優(yōu)化的LAMP對(duì)ORFV的檢測(cè)具有特異性、高靈敏性且更加方便等優(yōu)點(diǎn),從而更適用于現(xiàn)場(chǎng)的高效檢測(cè)。
【圖文】：

ＬＡＭＰ條件優(yōu)化的內(nèi)容包括：Ｍｇ２＋用量、甜菜堿的用量、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶的用量、ｄＮＴＰｓ的用量、內(nèi)外引物的濃度、ＬＡＭＰ方法檢測(cè)陽(yáng)性模板反應(yīng)的最佳時(shí)間和最佳溫度這７個(gè)方面。其中，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為１．５，２，２．５，３，３．５，４μＬ；甜菜堿（１ｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為０，２，３，５，６，７μＬ；ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（８０００Ｕ／ｍＬ）的用量分別為０．５，１，１．５，２，３μＬ；ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為１，２，３，，４，５，６μＬ；內(nèi)引物的濃度分別為１０，２０，４０，８０μｍｏｌ／Ｌ，外引物的濃度為５μｍｏｌ／Ｌ。通過(guò)上述各自試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行選擇并組合，選擇最佳ＬＡＭＰ反應(yīng)體系。反應(yīng)時(shí)間分別為３０，４５，６０，９０，１２０ｍｉｎ；反應(yīng)溫度分別為５９．４，６０．６，６２．０，６３．０，６４．０，６５．１℃。對(duì)ＬＡＭＰ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行１．５％瓊脂糖凝膠電泳分析。１．４ＬＡＭＰ顯色法檢測(cè)ＯＲＦＶ將上述優(yōu)化的條件結(jié)果進(jìn)行整合，進(jìn)行ＬＡＭＰ擴(kuò)增，用５００×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行不開(kāi)蓋顯色反應(yīng)。１．５ＬＡＭＰ檢測(cè)ＯＲＦＶ的特異性利用條件優(yōu)化的ＬＡＭＰ，通過(guò)與ＧＰＶ、ＳＰＶ、ＩＢＲＶ和ＢＰＩＶ３的ＤＮＡ檢測(cè)作對(duì)比，對(duì)ＯＲＦＶ檢測(cè)的特異性進(jìn)行試驗(yàn)。１．６ＬＡＭＰ檢測(cè)ＯＲＦＶ的靈敏性梯度稀釋ＯＲ－ＦＶ陽(yáng)性質(zhì)粒用于ＬＡＭＰ靈敏性檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的ＰＣＲ靈敏性

ＬＡＭＰ條件優(yōu)化的內(nèi)容包括：Ｍｇ２＋用量、甜菜堿的用量、ＢｓｔＤＮＡ聚合酶的用量、ｄＮＴＰｓ的用量、內(nèi)外引物的濃度、ＬＡＭＰ方法檢測(cè)陽(yáng)性模板反應(yīng)的最佳時(shí)間和最佳溫度這７個(gè)方面。其中，Ｍｇ２＋（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為１．５，２，２．５，３，３．５，４μＬ；甜菜堿（１ｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為０，２，３，５，６，７μＬ；ＢｓｔＤＮＡ聚合酶（８０００Ｕ／ｍＬ）的用量分別為０．５，１，１．５，２，３μＬ；ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）的用量分別為１，２，３，４，５，６μＬ；內(nèi)引物的濃度分別為１０，２０，４０，８０μｍｏｌ／Ｌ，外引物的濃度為５μｍｏｌ／Ｌ。通過(guò)上述各自試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行選擇并組合，選擇最佳ＬＡＭＰ反應(yīng)體系。反應(yīng)時(shí)間分別為３０，４５，６０，９０，１２０ｍｉｎ；反應(yīng)溫度分別為５９．４，６０．６，６２．０，６３．０，６４．０，６５．１℃。對(duì)ＬＡＭＰ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行１．５％瓊脂糖凝膠電泳分析。１．４ＬＡＭＰ顯色法檢測(cè)ＯＲＦＶ將上述優(yōu)化的條件結(jié)果進(jìn)行整合，進(jìn)行ＬＡＭＰ擴(kuò)增，用５００×ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行不開(kāi)蓋顯色反應(yīng)。１．５ＬＡＭＰ檢測(cè)ＯＲＦＶ的特異性利用條件優(yōu)化的ＬＡＭＰ，通過(guò)與ＧＰＶ、ＳＰＶ、ＩＢＲＶ和ＢＰＩＶ３的ＤＮＡ檢測(cè)作對(duì)比，對(duì)ＯＲＦＶ檢測(cè)的特異性進(jìn)行試驗(yàn)。１．６ＬＡＭＰ檢測(cè)ＯＲＦＶ的靈敏性梯度稀釋ＯＲ－ＦＶ陽(yáng)性質(zhì)粒用于ＬＡＭＰ靈敏性檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的ＰＣＲ靈敏性

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