【摘要】：2007年以來,亞洲新發(fā)H3N2亞型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)在我國廣泛流行,引起犬急性傳染病—犬流感。研究發(fā)現(xiàn),H3N2 CIV來源于禽源H3N2亞型流感病毒,經(jīng)變異演化后感染的犬。早期的實驗結(jié)果表明,H3N2 CIV可通過空氣在犬間傳播,也可繼續(xù)感染其它哺乳動物,包括鼠和豚鼠,但喪失對禽的感染力。禽源的H3N2 CIV對犬的致病機(jī)制到底如何,目前尚不清楚。HA和NA基因在流感病毒的致病方面起著重要作用。鑒于此,本研究用禽源病毒的HA或NA單基因替換掉H3N2 CIV的相應(yīng)基因,并拯救獲得了以H3N2 CIV為背景的重組病毒。將這些重組病毒感染BALB/c小鼠,確定了H3N2 CIV復(fù)制的關(guān)鍵基因及其氨基酸位點,并深入探討影響其復(fù)制的致病機(jī)制,具體內(nèi)容如下:1.確定H3N2 CIV復(fù)制的關(guān)鍵基因本研究早期篩選到了兩株高度同源的病毒,一株引起犬發(fā)病的犬流感病毒A/canine/influenza virus/01/2010(H3N2)(簡稱為C1)和一株不感染犬發(fā)病的禽流感病毒A/duck/shanghai/06/2009(H3N2)(簡稱為)D6,并建立這兩株病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。拯救得到與原毒株基因序列一致的重組病毒,分別命名為rC1和rD6。用D6毒株的HA或NA單基因替換C1對應(yīng)基因,并拯救得到以C1為背景的兩株重組病毒,分別命名為C1-D6HA和C1-D6NA。通過滴鼻途徑感染5周齡BALB/c小鼠,10~6EID_(50)/只。結(jié)果表明,親本毒rC1在鼠的肺臟中復(fù)制良好,而C1-D6NA基本上無法復(fù)制。同時,通過病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),感染了rC1毒株的小鼠肺臟有明顯的病理變化,而感染C1-D6NA毒株的小鼠肺臟基本無病理變化。根據(jù)這些結(jié)果,我們認(rèn)為CIV的NA基因可能是該病毒致病的關(guān)鍵基因。2.確定H3N2 CIV復(fù)制的關(guān)鍵氨基酸位點利用Lasergene 7.0軟件分析和比較了大量H3N2亞型犬流感病毒和同亞型的禽流感病毒的NA序列,最后在CIV的NA蛋白序列上鎖定了4個可疑的氨基酸位點,構(gòu)建相應(yīng)的pBD突變質(zhì)粒,并拯救獲得了4株點突變重組病毒,分別命名為C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)。小鼠致病性實驗表明,親本毒rC1和C1-NA(L24M)、C1-NA(G430R)病毒在鼠的肺臟上皆能良好復(fù)制,但C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)重組病毒無法在鼠肺臟中復(fù)制。進(jìn)一步地犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)增殖試驗結(jié)果與鼠的致病性結(jié)果相似。因此,我們認(rèn)為C1-NA的54K和154S可能是H3N2 CIV致病的關(guān)鍵氨基酸位點。3.H3N2 CIV復(fù)制的分子機(jī)制酶活性是流感病毒NA蛋白重要的功能之一。那么,CIV-NA的54K和154S是否通過調(diào)控NA蛋白的酶活性,從而影響H3N2 CIV的致病性呢?為此,利用無特異性病原(Specific pathogen free,SPF)雞胚擴(kuò)增rC1及其NA點突變重組病毒C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R),檢測NA酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)的NA酶活性明顯低于rC1及其他2株重組病毒C1-NA(L24M)和C1-NA(G430R),即54K和154S可顯著增強(qiáng)H3N2 CIV的NA酶活性。這種NA酶活性的改變,是否會影響病毒的釋放呢?為此,我們進(jìn)行了紅細(xì)胞病毒釋放試驗和子代病毒在MDCK上的釋放試驗。兩個試驗的結(jié)果皆表明,與rC1及其它2株重組病毒相比,C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)能顯著減緩病毒在細(xì)胞膜上的釋放能力。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)H3N2 CIV通過54K和154S增加NA蛋白的酶活性,促進(jìn)病毒在細(xì)胞膜上的釋放能力,從而有助于該病毒對哺乳動物的感染與復(fù)制,為進(jìn)一步有效防控該疫病提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

白(Nucleoprotein , NP)和基質(zhì)蛋白(Matrix, M)的抗原性的不同近年來有研究者在豬和牛體內(nèi)分離到新型的流感病毒，將其命15; Hause et al., 2013)。A 型流感病毒對人和動物的危害最為感大爆發(fā)。由于龐大的 A 流感病毒毒株，因此在核蛋白抗原tinin, HA)與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性進(jìn)行亞型有 18 種(H1-H18)，神經(jīng)氨酸酶共有 11 種(N1-N11)，除從蝙型以外(Tong et al., 2012)，其余 16 種 HA 和 9 種 NA 表面抗原型，如 H5N1 (Hatta et al., 2001)、H1N1 (Abed et al., 2004)、H9N al., 2013)等。20 世紀(jì)至今，，先后多次暴發(fā)的全球性大流感不脅著人類的健康。因此，密切關(guān)注流感病毒的流行情況，深跨宿主傳播機(jī)制對控制流感的暴發(fā)具有十分重要的作用。原學(xué)特點形態(tài)多樣，呈球狀，絲狀，棒狀等，但一般成熟的病毒粒子 100nm。病毒粒子由外到內(nèi)分別是雙層囊膜，基質(zhì)蛋白和核心

圖 2.1 C1 和 D6 全基因 PCR 電泳結(jié)果Fig.2.1 PRC products of 8 genes of C1 and D6A:C1, B:D6, M1:DL2000Marker, 1:PB2, 2:PB1, 3:PA, 4:HA, 5:NP, 6:NA, 7:M, 8:NS, 9:空白2.3.2全基因序列測序結(jié)果C1 和 D6 全基因組的 8 個基因片段的測序結(jié)果表明，各個基因的長度和氨基酸個數(shù)如下表(表2-6)。表 2.6 C1 和 D6 分離株堿基和氨基酸個數(shù)Table2.6 Numbers of basic group and amino acid of C1 and D6基因 片段長度(nt) 氨基酸個數(shù)(aa)C1-PB2 2342 760C1-PB1 2341 759C1-PA 2233 717C1-HA 1765 567C1-NP 1565 499C1-NA 1473 472
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2681233