【摘要】：TGF-β信號通路是參與肌肉和脂肪生長發(fā)育調(diào)控的重要信號通路之一,而且是肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的強(qiáng)抑制劑。Smads蛋白家族在TGF-β信號通路中起到至關(guān)重要的作用,它們能將信號由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞核中從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。而Smad2/Smad3是由激活素TGF-β激活的R-Smads。研究證實(shí)在TGF-β1抑制成肌和成脂分化過程中起到關(guān)鍵作用的是Smad3基因而不是Smad2基因。鑒于Smad3可能存在的抑制成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞分化的潛在作用,本研究通過腺病毒介導(dǎo)Smad3基因過表達(dá)和沉默的方法,探討Smad3在調(diào)控牛成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞分化過程中的作用。同時,雖然Smad2和Smad3的氨基酸相似性高,但其結(jié)構(gòu)、功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控都存在顯著的差異,本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平上對牛Smad2和Smad3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及相互之間的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。主要研究結(jié)果如下:(1)成功克隆了秦川牛Smad3基因CDS區(qū)序列,全長為1278bp,編碼了425個氨基酸殘基,并篩選得到一條靶向Smad3基因干擾效率高達(dá)83.3%的sh RNA序列。構(gòu)建了秦川牛Smad3基因的腺病毒穿梭載體p DC316-m CMV-EGFP-b SMAD3和p DC316-EGFP-Sh RNA-b SMAD3-1405,用這兩種攜帶目的基因的重組質(zhì)粒分別和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293A細(xì)胞中包裝病毒,擴(kuò)繁濃縮獲得為高滴度病毒,用La SRT法測定病毒滴度,過表達(dá)腺病毒AD-b Smad3和AD-NC(空載病毒)的滴度均為1×10~（10）PFU/m L;干擾腺病毒AD-Sh RNA-b SMAD3,AD-Sh RNA-NC(空病毒)的腺病毒滴度也均為1×10~（10）PFU/m L。(2)在前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)Smad3基因,顯著抑制了成脂標(biāo)志基因PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表達(dá),相反干擾沉默Smad3基因后,促進(jìn)了PPARγ,FABP4,C/EBPα和C/EBPβ的表達(dá)。油紅O染色發(fā)現(xiàn)在前體脂肪細(xì)胞過表達(dá)Smad3基因,抑制細(xì)胞中脂滴的積累,干擾沉默Smad3基因后,前體脂肪細(xì)胞中脂滴的含量升高。因而證明Smad3基因能夠顯著地抑制秦川牛前體脂肪細(xì)胞的分化。同樣,在成肌細(xì)胞中過表達(dá)Smad3基因,顯著抑制了肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因Myo D和Myo G的表達(dá),而干擾沉默Smad3基因后,促進(jìn)了Myo D和Myo G的表達(dá)。細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)干擾Smad3基因后,肌管變長變多。(3)克隆得到Smad3基因5'側(cè)翼序列1143bp,其核心啟動子區(qū)位于-337~-41bp之間。通過定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),確定了KLF6、KLF15、KLF7和MZF1在維持Smad3基因啟動子活性中的作用;體外EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是Smad3基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)染KLF6-si RNA、KLF15-si RNA、KLF7-si RNA、MZF1-si RNA以及對照Control si RNA到前體牛脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞中,采用Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),KLF6、KLF15、KLF7和MZF1是維持牛Smad3基因啟動子基本轉(zhuǎn)錄活性必需的順式作用元件。(4)采用Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),Smad2和Smad3基因在牛的各個組織中廣泛表達(dá),氨基酸相似性高達(dá)89.2%。在成肌細(xì)胞分化過程中,Smad2和Smad3基因表達(dá)趨勢相同,隨著肌管形成其表達(dá)量顯著增加。但是Smad3對Smad2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是抑制作用,無論是牛成肌細(xì)胞處于高血清生長培養(yǎng)基(GM:F12/DMEM+20%FBS)還是低血清培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基(DM:F12/DMEM+2%HS)。(5)采用5’末端c DNA快速擴(kuò)增法(SMART RACE c DNA Amplification),確定牛Smad2基因存在的的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),與已報道Smad2基因的mRNA序列(NM_001046218)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相比,我們將Smad2基因m RNA序列的5'UTR在原有基礎(chǔ)上向前推進(jìn)5 bp�？寺〉玫脚mad2基因5'側(cè)翼序列1243 bp,而其核心啟動子區(qū)域位于-158~-35bp。通過定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),確定了C/EBPα和C/EBPβ結(jié)合在Smad2基因核心啟動子區(qū)域。體外EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)C/EBPα和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合在牛Smad2基因的核心啟動子區(qū)域。(6)細(xì)胞培養(yǎng)基的不同會影響C/EBPα和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子、Smad2和Smad3基因的調(diào)控。在低血清的分化培養(yǎng)基條件下的牛成肌細(xì)胞中C/EBPα和C/EBPβ抑制Smad2基因的表達(dá),Smad3基因促進(jìn)C/EBPα和C/EBPβ基因的表達(dá);而在高血清生長培養(yǎng)基條件下的牛成肌細(xì)胞中,C/EBPα和C/EBPβ轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)Smad2基因的表達(dá),Smad3基因抑制C/EBPα和C/EBPβ基因的表達(dá)。Smad3基因調(diào)控Smad2基因的表達(dá)可能是通過調(diào)控其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和C/EBPβ的表達(dá)。綜上所述:本文應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)與干擾沉默技術(shù),探討了Smad3基因在調(diào)控秦川牛前體脂肪細(xì)胞與成肌細(xì)胞分化過程中的作用,以及對一些在肌肉生長發(fā)育和脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用的功能基因轉(zhuǎn)錄水平的影響;也探討了Smad2和Smad3基因之間在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究TGF-β信號通路在秦川牛肌肉和脂肪的形成過程中的調(diào)控機(jī)制提供一定的理論依據(jù),也為下一步的中國肉牛育種工作奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

從而下調(diào)了 PPAR γ 的表達(dá)(Alves et al. 2017; Choy et al. 2000)。鑒于 Smad3 可能存在的抑制牛成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞分化的潛在作用，我們通過腺病毒介導(dǎo) Smad3 基因在秦川牛前體脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞中過表達(dá)和沉默，再應(yīng)用油紅 O 染色、實(shí)時熒光定量PCR 等技術(shù)，探討 Smad3 在調(diào)控牛成肌細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制。近期有研究表明在小鼠上，雖然Smad2和Smad3的氨基酸相似性高達(dá)92%，對TGFβ信號通路來說同等重要，，但是二者在細(xì)胞內(nèi)的比例卻會影響 TGFβ 抑制細(xì)胞生長作用(Kim et al. 2005)。因而我們提出假設(shè)是否存在一種因子能夠調(diào)控兩種信號通路之間的平衡。本實(shí)驗(yàn)通過克隆 Smad2 和 Smad3 基因啟動子序列，雙報告系統(tǒng)檢測核心啟動子序列，定點(diǎn)突變，EMSA 方法鑒定其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；在轉(zhuǎn)錄水平上初步探索目標(biāo)基因 Smad2與 Smad3 之間的調(diào)控關(guān)系。本研究可為探明 Smad2 和 Smad3 基因在調(diào)控大型家畜（牛）肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究牛 TGFβ 信號通路在秦川牛骨骼肌和脂肪的生長發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。1.2 成肌細(xì)胞分化研究進(jìn)展1.2.1 成肌細(xì)胞分化的起源

1.3 脂肪細(xì)胞分化研究進(jìn)展1.3.1 脂肪細(xì)胞分化的起源許多研究已經(jīng)證明脂肪細(xì)胞是由中胚層的多能干細(xì)胞發(fā)育分化而來的。根據(jù)在脂肪細(xì)胞的分化過程中脂滴發(fā)生的變化一般可將脂肪細(xì)胞分為，脂肪母細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞(Aggarwal et al. 2005; Rodriguez et al. 2004)。脂肪組織的增長是脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加以及體積增大的結(jié)果。前體脂肪細(xì)胞是脂肪組織基本的生物學(xué)單位，其增殖分化能力的持續(xù)存在伴隨著動物的一生(Rodriguez et al. 2004)。前體脂肪細(xì)胞還是一種新發(fā)現(xiàn)的多能干細(xì)胞。近年來前體脂肪細(xì)胞不僅是可以用于研究動物脂肪組織的發(fā)育形成以及分泌脂肪細(xì)胞因子等過程， 也可以作為細(xì)胞模型用來在體外研究動物脂肪組織的生脂過程以及其代謝調(diào)控的分子機(jī)制。因而對前體脂肪細(xì)胞的研究不僅對改善動物的胴體品質(zhì)、改良動物品種和提高人們的生活水平上有著重要意義， 而且在研究人類的糖尿病、肥胖癥、相關(guān)的代謝疾病以及組織移植等方面都有著較為廣泛的應(yīng)用前景(Poulos et al. 2016)。但是，前體脂肪細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育形成脂肪組織過程中確切的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823

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本文編號：2676037