【摘要】：旋毛蟲病由旋毛蟲引起,是一種人獸共患病,嚴(yán)重威脅人類的健康,在世界范圍內(nèi)廣泛流行。感染者由于食入含有感染性包囊的生的或者未加工完全的肉類食品而感染,具有較高的感染率。人感染后臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱,呼吸困難,腹瀉,水腫等,對(duì)人類健康產(chǎn)生很大威脅。旋毛蟲排泄分泌抗原(ES抗原),主要由蟲體排泄分泌產(chǎn)生,由于旋毛蟲成蟲體外培養(yǎng)存活時(shí)間短,所以目前應(yīng)用于研究的ES抗原主要來(lái)自肌幼蟲時(shí)期。ES抗原能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng),因此現(xiàn)階段被頻繁用于旋毛蟲病的診斷、疫苗以及免疫等方面。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是一類蛋白質(zhì)超家族,研究證實(shí),在生物體凝血、補(bǔ)體活化等多個(gè)生理反應(yīng)中均有絲氨酸蛋白酶抑制劑的存在,起到至關(guān)重要的作用。旋毛蟲SPI是旋毛蟲ES抗原中為數(shù)不多的特異性抗原之一,在免疫預(yù)防和診斷方面作用重大,所以,本研究選擇旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進(jìn)行旋毛蟲感染方法的建立。本研究中選用純化后的旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑以及旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原作為包被抗原,建立間接ELISA檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)條件進(jìn)行一系列的優(yōu)化。最終確定抗原的最佳包被量TsAdSPI為0.09375μg/孔,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1.5μg/孔;最佳血清稀釋比例TsAdSPI為1:400,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:100;二抗最佳稀釋比例TsAdSPI為1:6000,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:5000;敏感度TsAdSPI為1:12800,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:6400;宿主敏感性試驗(yàn)中TsAdSPI最早在感染20條旋毛蟲感染14 d時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性,ES抗原最早在感染20條旋毛蟲感染21 d時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性;在特異性試驗(yàn)中,本研究選用日本血吸蟲和華支睪吸蟲,試驗(yàn)結(jié)果顯示均未出現(xiàn)交叉反應(yīng);選用生產(chǎn)批號(hào)不同的酶標(biāo)板進(jìn)行批間和批內(nèi)的重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果顯示兩種重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%。臨床檢測(cè)80份樣品,TsAdSPI陽(yáng)性檢出率為36.25%(29/80),ES抗原為26.25%(21/80),試驗(yàn)結(jié)果證明TsAdSPI敏感性高于ES抗原。利用純化后的TsAdSPI和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進(jìn)行包被,以NC膜作為固相載體建立Dot-ELISA檢測(cè),同時(shí)對(duì)條件進(jìn)行一系列的優(yōu)化。最終確定最佳抗原包被量TsAdSPI為0.25μg/片,ES抗原為2μg/片;最佳血清稀釋比例分別為1:400和1:200;最佳二抗稀釋比例分別為1:8000,和1:6000;敏感性TsAdSPI可達(dá)到1:12800,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原可達(dá)到1:6400;宿主敏感性試驗(yàn)中TsAdSPI最早在感染50條旋毛蟲感染14 d時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性,ES抗原最早在感染100條旋毛蟲感染14 d時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性;對(duì)3個(gè)批次的膜片進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),兩種蛋白重復(fù)性均理想;在特異性試驗(yàn)中,本研究選用日本血吸蟲和華支睪吸蟲,試驗(yàn)結(jié)果顯示均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。臨床檢測(cè)80份樣本結(jié)果顯示,TsAdSPI陽(yáng)性檢出率為26.25%(21/80),旋毛蟲肌幼蟲ES抗原陽(yáng)性檢出率為15%(12/80),試驗(yàn)結(jié)果證明旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑比P53更具有敏感性。利用TsAdSPI和P53基因?yàn)榘行蛄蟹謩e設(shè)計(jì)并合成引物,以不同感染天數(shù)不同感染旋毛蟲條數(shù)的小鼠血液提取的DNA為模板,進(jìn)行PCR檢測(cè),同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照,旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性10 min,95℃30 s、56.7℃30 s、72℃1min,72℃10 min共30-35個(gè)循環(huán)。P53反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性10 min,95℃30 s、52.9℃30s、72℃74 s,72℃10 min共30-35個(gè)循環(huán)。結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示利用旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑為引物最早在感染8條旋毛蟲感染24 h時(shí)擴(kuò)增出目的條帶,感染7 d后所有試驗(yàn)樣本均擴(kuò)增出特異性條帶;而以P53為引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明僅在感染旋毛蟲超過(guò)50條且感染時(shí)間在14 d后才可擴(kuò)增出目的條帶。對(duì)80份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),以TsAdSPI為引物陽(yáng)性檢出率為43.75(35/80)以P53為引物陽(yáng)性檢出率為13.75(11/80)試驗(yàn)表明旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑比P53更具有敏感性。
【圖文】：

圖 3-1 抗原最佳包被量確定Fig. 3-1 The optimum amount of antigen is determined當(dāng) TsAdSPI 蛋白包被量為 0.25 μg/片時(shí)膜片中央斑點(diǎn)顯色較為均勻和明顯，因此確g/片為最佳包被量。.2 最佳封閉液的確定

封閉液的確定Fig.3-2Blockingfluiddetermination
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S855.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 蓋文燕;李文卉;張念章;曲自剛;付寶權(quán);;旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsSerpin)基因的克隆及序列分析[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2014年12期

2 朱敬;衛(wèi)榮華;;斑點(diǎn)ELISA與環(huán)幼沉淀試驗(yàn)診斷旋毛蟲病的研究[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2014年02期

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4 羅玉嬌;李濱;舒衡平;蔣立平;;Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生化藥物雜志;2012年03期

5 李曉云;路義鑫;韓彩霞;朱江巍;宋銘忻;;P49重組抗原檢測(cè)旋毛蟲抗體的間接ELISA方法建立[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2011年12期

6 李峰;王中全;崔晶;王書偉;李楠;;PCR檢測(cè)感染早期小鼠血液中旋毛蟲幼蟲的研究[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年12期

7 余禮軍;郭鄂平;周紅;;S-CLPT、Dot-ELISA法和IEST檢測(cè)旋毛蟲抗體的研究[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2009年18期

8 朱艷梅;韓彩霞;路義鑫;宋銘忻;;旋毛蟲P53ES抗原基因的克隆及真核表達(dá)[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2009年01期

9 王中全;崔晶;;旋毛蟲病的診斷與治療[J];中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2008年01期

10 鄭青亮;盛清;張耀洲;;Kazal型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年05期

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3 王艷鳳;偽旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑在寄生蟲免疫逃逸中的功能分析[D];吉林大學(xué);2015年

4 孫召金;旋毛蟲排泄分泌物抗原在鼠和豬免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2015年

5 龐宇;旋毛蟲p43與p53核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 任科研;應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)對(duì)豬旋毛蟲病診斷方法的研究[D];吉林大學(xué);2012年

7 孫樹民;旋毛蟲肌幼蟲p53 kDa和p45 kDa抗原基因的克隆、表達(dá)及鑒定[D];吉林大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：2674793