【摘要】：旋毛蟲病由旋毛蟲引起,是一種人獸共患病,嚴重威脅人類的健康,在世界范圍內(nèi)廣泛流行。感染者由于食入含有感染性包囊的生的或者未加工完全的肉類食品而感染,具有較高的感染率。人感染后臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱,呼吸困難,腹瀉,水腫等,對人類健康產(chǎn)生很大威脅。旋毛蟲排泄分泌抗原(ES抗原),主要由蟲體排泄分泌產(chǎn)生,由于旋毛蟲成蟲體外培養(yǎng)存活時間短,所以目前應用于研究的ES抗原主要來自肌幼蟲時期。ES抗原能夠誘導宿主產(chǎn)生免疫反應,因此現(xiàn)階段被頻繁用于旋毛蟲病的診斷、疫苗以及免疫等方面。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是一類蛋白質(zhì)超家族,研究證實,在生物體凝血、補體活化等多個生理反應中均有絲氨酸蛋白酶抑制劑的存在,起到至關重要的作用。旋毛蟲SPI是旋毛蟲ES抗原中為數(shù)不多的特異性抗原之一,在免疫預防和診斷方面作用重大,所以,本研究選擇旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進行旋毛蟲感染方法的建立。本研究中選用純化后的旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑以及旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原作為包被抗原,建立間接ELISA檢測方法,同時對條件進行一系列的優(yōu)化。最終確定抗原的最佳包被量TsAdSPI為0.09375μg/孔,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1.5μg/孔;最佳血清稀釋比例TsAdSPI為1:400,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:100;二抗最佳稀釋比例TsAdSPI為1:6000,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:5000;敏感度TsAdSPI為1:12800,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原為1:6400;宿主敏感性試驗中TsAdSPI最早在感染20條旋毛蟲感染14 d時檢測為陽性,ES抗原最早在感染20條旋毛蟲感染21 d時檢測為陽性;在特異性試驗中,本研究選用日本血吸蟲和華支睪吸蟲,試驗結果顯示均未出現(xiàn)交叉反應;選用生產(chǎn)批號不同的酶標板進行批間和批內(nèi)的重復試驗,結果顯示兩種重復試驗的變異系數(shù)均小于10%。臨床檢測80份樣品,TsAdSPI陽性檢出率為36.25%(29/80),ES抗原為26.25%(21/80),試驗結果證明TsAdSPI敏感性高于ES抗原。利用純化后的TsAdSPI和旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進行包被,以NC膜作為固相載體建立Dot-ELISA檢測,同時對條件進行一系列的優(yōu)化。最終確定最佳抗原包被量TsAdSPI為0.25μg/片,ES抗原為2μg/片;最佳血清稀釋比例分別為1:400和1:200;最佳二抗稀釋比例分別為1:8000,和1:6000;敏感性TsAdSPI可達到1:12800,旋毛蟲肌幼蟲ES抗原可達到1:6400;宿主敏感性試驗中TsAdSPI最早在感染50條旋毛蟲感染14 d時檢測為陽性,ES抗原最早在感染100條旋毛蟲感染14 d時檢測為陽性;對3個批次的膜片進行重復性試驗,兩種蛋白重復性均理想;在特異性試驗中,本研究選用日本血吸蟲和華支睪吸蟲,試驗結果顯示均未出現(xiàn)交叉反應。臨床檢測80份樣本結果顯示,TsAdSPI陽性檢出率為26.25%(21/80),旋毛蟲肌幼蟲ES抗原陽性檢出率為15%(12/80),試驗結果證明旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑比P53更具有敏感性。利用TsAdSPI和P53基因為靶序列分別設計并合成引物,以不同感染天數(shù)不同感染旋毛蟲條數(shù)的小鼠血液提取的DNA為模板,進行PCR檢測,同時設陽性和陰性對照,旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的PCR反應程序為95℃變性10 min,95℃30 s、56.7℃30 s、72℃1min,72℃10 min共30-35個循環(huán)。P53反應程序為95℃變性10 min,95℃30 s、52.9℃30s、72℃74 s,72℃10 min共30-35個循環(huán)。結束后對PCR產(chǎn)物進行鑒定,結果顯示利用旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑為引物最早在感染8條旋毛蟲感染24 h時擴增出目的條帶,感染7 d后所有試驗樣本均擴增出特異性條帶;而以P53為引物進行PCR檢測,結果表明僅在感染旋毛蟲超過50條且感染時間在14 d后才可擴增出目的條帶。對80份臨床樣本進行檢測,以TsAdSPI為引物陽性檢出率為43.75(35/80)以P53為引物陽性檢出率為13.75(11/80)試驗表明旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑比P53更具有敏感性。
【圖文】：

圖 3-1 抗原最佳包被量確定Fig. 3-1 The optimum amount of antigen is determined當 TsAdSPI 蛋白包被量為 0.25 μg/片時膜片中央斑點顯色較為均勻和明顯，因此確g/片為最佳包被量。.2 最佳封閉液的確定

封閉液的確定Fig.3-2Blockingfluiddetermination
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S855.9

【參考文獻】

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本文編號：2674793