【摘要】：乳酸桿菌作為一種益生菌在動物腸道中發(fā)揮重要的益生效應(yīng)。其粘附特性是益生菌在腸道內(nèi)成功定植發(fā)揮益生性的基礎(chǔ),并且成為篩選高效益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。乳酸桿菌表面蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)在細胞表面發(fā)揮粘附腸道表層粘液素的作用。但是GAPDH由胞漿分泌到細胞表面的跨膜分泌規(guī)律和菌體表面的分布特征尚不明確,闡明GAPDH發(fā)揮對豬腸道粘液素的粘附作用,對于篩選和培育高效乳酸菌有重要意義。本試驗旨在以具有高粘附性的乳酸桿菌ZJ617和低粘附性乳酸桿菌ZJ615為代表,研究表面蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)在乳酸桿菌不同生長期的分泌特性及其粘附粘液素參與腸道粘附作用。低黏附ZJ615和高黏附ZJ617羅伊氏乳酸桿菌培養(yǎng)不同時間(3、6、9、12、15、18 h),以氯化鋰提取表面蛋白,免疫印跡(Western blotting)定量表面蛋白GAPDH含量;二乙酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)雙染色法結(jié)合流式細胞儀檢測細胞膜通透性;利用免疫電鏡定位不同生長時期乳酸桿菌表面蛋白GAPDH;兩種菌培養(yǎng)至18h(平臺期)與載玻片固定豬腸道粘液素共同孵育1h,分析抗體封閉表面蛋白GAPDH、高碘酸氧化粘液素或抗體封閉加氧化雙重處理后,革蘭氏染色分析乳酸桿菌粘附數(shù)量;分子互作儀ForteBio分析不同處理條件下乳酸桿菌與粘液素的動力學(xué)結(jié)合特征。研究結(jié)果表明:1)乳酸桿菌表面蛋白GAPDH含量在6h(對數(shù)生長期)最高(P0.05),進入生長后期(12h、15h、18h)后含量顯著下降(P0.05);高黏附乳酸桿菌ZJ617不同培養(yǎng)時間的GAPDH蛋白含量均高于ZJ615(P0.05)。2)乳酸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期(6h)細胞膜通透性最高(P0.05),生長后期(12h、15h、18h)通透性降低(P0.05);高粘附乳酸桿菌ZJ617不同時間細胞膜通透性均高于ZJ615(P0.05)。ZJ617和ZJ615不同培養(yǎng)時間表面蛋白GAPDH分泌量和細胞膜通透性相關(guān)性分別為0.8和0.6。3)與載玻片固定有粘液素時,乳酸桿菌的粘附數(shù)量相比,無粘液素固定、抗體封閉GAPDH、高碘酸氧化粘液素后乳酸桿菌粘附數(shù)量顯著降低(P0.05);抗體封閉和高碘酸氧化雙重處理,乳酸桿菌粘附數(shù)量進一步顯著降低(P0.05);上述各處理下,高粘附乳酸桿菌ZJ617粘附數(shù)量顯著高于低黏附ZJ615(P0.05)。動力學(xué)相互作用結(jié)果顯示,與對照組相比,各處理組:高碘酸氧化、去蛋白、加熱和抗體封閉之后,各組反應(yīng)值均減弱。由此可見,對數(shù)生長期乳酸桿菌表面蛋白GAPDH含量最高,其分泌與細胞膜通透性成正相關(guān);高黏附乳酸桿菌具有表面蛋白GAPDH,通過粘附腸道粘液素在乳酸桿菌腸道定植中發(fā)揮作用。
【圖文】：

長比例法檢測[52]。通過熒光探針法可以快速方便的檢測出細胞中離子差異，從而得到細胞膜通透性的變化。1.2.2.3 流式細胞儀檢測流式細胞儀可以快速準(zhǔn)確的定量多個細胞的狀態(tài)，結(jié)合熒光探針二乙酸熒光素（fluorescein diacetate, FDA）和碘化丙啶（propidium iodide, PI）標(biāo)記特異性，分析細胞膜通透性[53-54]。FDA 只能與具有完整細胞膜結(jié)構(gòu)的細胞結(jié)合，本身不帶電荷的脂質(zhì)性分子、 不發(fā)熒光，但通過自由擴散進入細胞后可被酶水解為熒光素，由于其極性而留存于細胞中，若細胞通透性增加，F(xiàn)DA 流出細胞外，細胞無法發(fā)出熒光。然而與 FDA 不同的是，當(dāng)細胞膜通透性增加時，PI 可以通過細胞膜并且與核酸作用發(fā)紅色熒光[55]。有研究通過激光誘導(dǎo)沖擊波，導(dǎo)致細胞產(chǎn)生可修復(fù)性損傷，提高細胞膜通透性，采用 FDA 和 PI 雙染色檢測法運用流式細胞儀檢測了細胞膜通透性的變化[56]。作者所在課題組利用 FDA 和 PI 雙染色法檢測不同時間乳酸桿菌細胞膜通透性，通過流式細胞儀檢測所獲得的點狀圖表現(xiàn)出一定的差異。被 FDA 染色的細胞會落在 Q3 象限，，被 PI 染色的細胞會顯示在 Q1 象限，說明不同培養(yǎng)時間乳酸桿菌細胞膜通透性是不同的（圖 1）。

6×109CFU/ml。表 2.1 不同培養(yǎng)時間乳酸桿菌菌數(shù)統(tǒng)計（CFU/ml）Table2.1Statistics of lactobacillus bacteria at different culture time培養(yǎng)時間（h） 3 6 9 12 15 18ZJ615 6.3×1071.6×1085×1083×1086.2×1098×109ZJ617 1.3×1075.3×1072.0×1086×1089.2×1081.2×109乳酸桿菌 ZJ615 和 ZJ617 分別厭氧培養(yǎng)不同時間，將不同時間乳酸桿菌菌數(shù)調(diào)整約 6×109CFU/ml。離心后菌體經(jīng)過氯化鋰提取表面蛋白，western blot 定位不同時間表面蛋白 GAPDH 的含量，研究結(jié)果顯示：乳酸桿菌表面蛋白 GAPDH 含量在 6h（對數(shù)生長期）最高（P＜0.05），進入生長后期（12h、15h、18h）后含量顯著下降（P＜0.05）；高黏附乳酸桿菌 ZJ617 不同培養(yǎng)時間的 GAPDH 蛋白含量均高于 ZJ615（P＜0.05）（圖 2.1）。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.6

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