【摘要】：豬鏈球菌2型(SS2)作為重要的人獸共患病原菌,可造成腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及中毒樣休克綜合征(STSLS)等,不僅在世界范圍內(nèi)造成了養(yǎng)豬業(yè)的重大損失,還嚴(yán)重威脅人類健康。截至目前SS2的致病機(jī)制仍未完全闡明。實(shí)驗(yàn)室前期通過轉(zhuǎn)座子突變體庫篩選到一個(gè)潛在的毒力相關(guān)因子PrlP,分析發(fā)現(xiàn)其屬于XRE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究其對SS2毒力的影響,并系統(tǒng)解析其機(jī)制,對進(jìn)一步揭示SS2致病機(jī)制具有重要意義。為確定PrlP對SS2毒力的影響,本研究以SS2 SC19株為親本株,構(gòu)建了prl P基因缺失菌株Δprl P和回補(bǔ)菌株CΔprl P,對它們的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)prl P基因缺失菌株Δprl P于體外培養(yǎng)條件下鏈長顯著變長。小鼠感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,prl P基因缺失后,感染小鼠的致死率顯著下降、臨床癥狀顯著減輕;同時(shí)在小鼠體內(nèi)定植能力、誘導(dǎo)炎癥因子水平和組織損傷能力均顯著下降,而回補(bǔ)該基因后這些性狀回復(fù)或部分回復(fù);說明prl P基因?yàn)镾S2的重要毒力相關(guān)基因。由于XRE家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子N-端結(jié)構(gòu)域相對保守(HTH型特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、C端結(jié)構(gòu)域高度可變的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為進(jìn)一步探究影響SS2毒力的PrlP關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,我們分別構(gòu)建了PrlP N-端結(jié)構(gòu)域及C-端結(jié)構(gòu)域缺失突變株(ΔN(prl P)及ΔC(prl P)),并分析了它們的生物學(xué)特性和對小鼠的致病性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PrlP C-端結(jié)構(gòu)域缺失菌株ΔC(prl P)的生物學(xué)特性與致病性與野生株沒有顯著差別;而PrlP N-端結(jié)構(gòu)域缺失菌株ΔN(prl P)的生物學(xué)特性和對小鼠致病性與PrlP缺失菌株Δprl P基本一致:PrlP N-端結(jié)構(gòu)域缺失后,感染小鼠的致死率顯著下降、臨床癥狀顯著減輕;同時(shí)在小鼠體內(nèi)定植能力、誘導(dǎo)炎癥因子水平和組織損傷能力均顯著下降,而在Δprl P中回補(bǔ)該結(jié)構(gòu)域的菌株CΔN(prl P)可以回復(fù)或部分回復(fù)這些表型。此外,體外吞噬實(shí)驗(yàn)表明,PrlP或其N-端結(jié)構(gòu)域缺失后,SS2抗吞噬能力下降。以上結(jié)果表明,N-端結(jié)構(gòu)域是PrlP調(diào)節(jié)SS2致病力的主要結(jié)構(gòu)域。為了解析PrlP調(diào)控SS2毒力的機(jī)制,本研究通過RNAseq系統(tǒng)解析PrlP及其N-端結(jié)構(gòu)域調(diào)控SS2基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比野生株,PrlP缺失株及其N-端結(jié)構(gòu)域缺失株有大量相同的差異表達(dá)基因。其中包括與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞生長與分裂、細(xì)胞壁/膜/胞膜合成、DNA復(fù)制重組與修復(fù)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及防御機(jī)制等多種生命活動(dòng)相關(guān)的基因。上述差異表達(dá)基因中,毒力相關(guān)基因Cia RH、Stk/Stp、ssp A-1、hp1330、fur等表達(dá)量顯著下調(diào);而細(xì)胞分裂相關(guān)基因mre C、mre D、stk等基因表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)。提示PrlP或其N-端結(jié)構(gòu)域可能通過調(diào)節(jié)上述基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)SS2毒力和鏈長。綜上所述,PrlP為豬鏈球菌2型重要全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其可通過調(diào)控SS2多種基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控SS2毒力及其他表型,并且這種調(diào)控作用主要由其N-端結(jié)構(gòu)域(HTH型特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)實(shí)現(xiàn)。后續(xù)利用Ch IPseq等對PrlP直接/間接結(jié)合毒力基因的進(jìn)一步研究將為深入解析SS2毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

在 SS2 SC84 株的全基因組序列中，PrlP 編碼基因?yàn)?SSUSC84_0951，共 801 個(gè)堿基，編碼 266 個(gè)氨基酸，位于染色體正鏈（如圖 4-1）。通過將 prlP 基因序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行 BlastP 比對，發(fā)現(xiàn)該基因在 S.suis 中廣泛存在并高度保守。將 PrlP 氨基酸序列在 Interpro 數(shù)據(jù)庫和 NCBI 網(wǎng)站 Conserved domains 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白 N 端（1-74 氨基酸）為 HTH 型 XRE 超家族蛋白結(jié)構(gòu)域，包含有多個(gè)特異性 DNA 結(jié)合位點(diǎn)（如圖 4-2；）該蛋白 C 端（146-263 氨基酸）為功能未知的肽酶結(jié)構(gòu)域。推測該蛋白為 XRE 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。圖 4-1 SS2 中 prlP 基因座的示意圖Fig. 4-1 Schematic representation of the prlP locus in SS2

圖 4-3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定ntification of recombinant plasmids by enzrker；1、2：BamH I:/Pst I 雙酶切重組質(zhì)粒失突變株的篩選與鑒定4s-ΔprlP 電轉(zhuǎn)入 SS2 野生株 SC19 后，篩選對壯觀霉素敏感的雙交換菌株。ΔprlP-L-1、ΔprlP-R-2）對其進(jìn)行 P次擴(kuò)增，，并送樣測序，確保菌株發(fā)生止密碼子 TGA，完全缺失 prlP 基因 8
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉琳璐;吳光燕;張煒;;豬鏈球菌2型Dbp缺失株的構(gòu)建及特性分析[J];微生物學(xué)通報(bào);2015年07期

2 霍春月;紀(jì)穎;任麗麗;張靜;孔軍伶;;血清型2型豬鏈球菌烯醇化酶參與豬鏈球菌抗吞噬作用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年11期

3 付忠琳;駢亞亞;李雪琴;鄭玉玲;馬世良;袁媛;霍春月;;2型豬鏈球菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)SalK/SalR抗吞噬機(jī)制的初步研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年06期

4 拜廷陽;閆若潛;吳志明;普志平;盛敏;楊增岐;;豬鏈球菌病研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年09期

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1 李宗梅;嗜熱鏈球菌發(fā)酵中酸性相關(guān)基因的篩選與分析[D];天津科技大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2674292