【摘要】：T細(xì)胞免疫應(yīng)答在宿主抵抗胞內(nèi)病原感染過程中扮演重要角色,同時(shí)對(duì)B細(xì)胞的效應(yīng)功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞完全活化不僅依賴于MHC-抗原肽-TCR介導(dǎo)的抗原特異性信號(hào),還需要CD28和4-1BB等分子介導(dǎo)的共刺激信號(hào)。增強(qiáng)第二信號(hào)可以降低T細(xì)胞活化時(shí)對(duì)第一信號(hào)的需求,即降低T細(xì)胞活化的閾值。一旦缺失第二信號(hào),T細(xì)胞將出現(xiàn)反應(yīng)無能從而導(dǎo)致病原逃避宿主的免疫防御。目前,靶向共刺激信號(hào)分子如CTLA-4和PD-1的免疫治療已取得重大突破。鑒于我國養(yǎng)豬業(yè)頻繁遭受各種傳染性疾病的侵襲,提高豬群的抗病能力無疑是一種快速而有效的解決手段。在本研究中,我們擬通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)高表達(dá)豬共刺激分子CD28和4-1BB來增強(qiáng)疫苗的免疫效果,從而提升豬群的抗病能力。基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯分別將目的基因CD28或4-1BB定點(diǎn)整合到豬胎兒成纖維細(xì)胞的Rosa26位點(diǎn),獲得2株CD28轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和4株4-1BB轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因豬,成功獲得5頭F0代CD28轉(zhuǎn)基因豬和3頭F0代4-1BB轉(zhuǎn)基因豬。鑒定結(jié)果顯示,CD28和4-1BB均定點(diǎn)整合到預(yù)期位點(diǎn),且能穩(wěn)定表達(dá),二者的mRNA水平分別高于同窩陰性仔豬。此外,血常規(guī)及生化指標(biāo)顯示CD28或4-1BB轉(zhuǎn)基因?qū)ψ胸i的生理健康無副作用。為驗(yàn)證高表達(dá)CD28和4-1BB能否增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)效果,本研究以豬繁殖與呼吸綜合征病毒為模型,分別在疫苗免疫和攻毒后,檢測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD28轉(zhuǎn)基因豬T細(xì)胞活化水平明顯升高,而4-1BB為誘導(dǎo)性表達(dá),對(duì)維持T細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要作用。免疫后28天,CD28轉(zhuǎn)基因豬CD4 T細(xì)胞的比例(26.03 ± 1.28%)顯著高于野生型豬(21.57 ± 0.91%,P=0.046),其病毒中和抗體水平為野生型豬的2倍。50倍劑量的疫苗毒株攻毒后10天,轉(zhuǎn)基因豬的臨床癥狀較輕。轉(zhuǎn)基因豬中和抗體滴度仍維持較高水平,CD8T細(xì)胞分泌IFN-y能力顯著增強(qiáng),血清中的病毒載量顯著降低(P=0.02)。而4-1BB轉(zhuǎn)基因?qū)RRSV抗體水平無顯著影響,但可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α的分泌。進(jìn)一步CTL體外殺傷試驗(yàn)結(jié)果顯示,4-1BB轉(zhuǎn)基因顯著增強(qiáng)CTL對(duì)PRRSV感染靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。為探究CD28轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗骺垢腥灸芰Φ挠绊?我們以弓形蟲Toxoplasma gondii為病原模型,檢測(cè)感染后T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型豬相比,CD28轉(zhuǎn)基因豬抗弓形蟲感染的適應(yīng)性免疫應(yīng)答無顯著差異,但其肝臟、肌肉等組織中的載蟲量明顯降低。該結(jié)果表明,CD28轉(zhuǎn)基因豬具有一定的抗弓形蟲感染的能力,但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。綜上,本研究獲得了定點(diǎn)整合且能穩(wěn)定表達(dá)一額外拷貝的CD28或4-1BB轉(zhuǎn)基因豬,揭示了兩種共刺激分子均可以促進(jìn)T細(xì)胞的效應(yīng)功能,提升疫苗免疫效果和宿主的抗感染能力,為我國抗病育種事業(yè)提供了廣譜抗病基因和新的研究策略。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)室前期己成功獲得ＣＤ２８和４－１ＢＢ兩種啟動(dòng)子，并驗(yàn)證了其調(diào)控效率。逡逑我們以ＰＢＭＣｃＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴(kuò)增獲得ＣＤ２８和４－１ＢＢ的編碼序列，并融合Ｆｌａｇ標(biāo)簽，逡逑電泳檢測(cè)目的片段大小。結(jié)果顯示，ＣＤ２８／Ｆｌａｇ和４－ｌＢＢ／Ｆｌａｇ大小分別為６８４ｂｐ和７５０ｂｐ（如圖２－３Ａ逡逑和Ｂ所示）。逡逑本研宄通過ｏｖｅｒｌａｐ邋ＰＣＲ方法分別將ＣＤ２８或４－１ＢＢ的啟動(dòng)子，，ＣＤ２８或４－１ＢＢ的ＣＤＳ序逡逑列（Ｃ端融合Ｆｌａｇ標(biāo)簽），ＣＤ２８或４－１ＢＢ的３’ＵＴＲ串連，分別得到ＣＤ２８或４－１ＢＢ表達(dá)框，并在逡逑兩個(gè)表達(dá)框上下游引入酶切位點(diǎn)，上游為ＥｃｏＲＶ，下游為ＡｓｃＩ和Ｋｐｎｌ。逡逑經(jīng)電泳檢測(cè)，ＣＤ２８表達(dá)框大小為３．８邋ｋｂ，邋４－１ＢＢ表達(dá)框大小為４．４邋ｋｂ，均與預(yù)期相符（如圖逡逑３０逡逑

利用已公布的豬０ＣＴ４調(diào)控序列，設(shè)計(jì)引物，以成纖維細(xì)胞系ＹＫＸ００１基因組ＤＮＡ為模板，逡逑擴(kuò)增ＯＣＴ４啟動(dòng)子，同時(shí)在５’端引入ＬｏｘＰ序列和Ｋｐｎｌ酶切位點(diǎn)。逡逑電泳檢測(cè)目的片段大小接近３．４邋ｋｂ，與預(yù)期相符（如圖２－４Ａ所示）。回收ＰＣＲ產(chǎn)物，連Ｔ載逡逑體。小提質(zhì)粒，利用Ｋｐｎｌ、Ｎｄｅｌ和ＲｓｒＩＩ三種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，條帶大小與預(yù)期相符，測(cè)序逡逑正確（如圖２－４Ｂ所示）。逡逑３１逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

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2 曾芳;李紫聰;董銳;吳珍芳;王

本文編號(hào)：2674153