【摘要】：犬細(xì)小病毒(CPV)是能夠引起犬出血性胃腸炎和心肌炎的高傳染性和高致死性的疾病。通過(guò)糞-口傳播,健康動(dòng)物接觸感染動(dòng)物的糞便或者污染的表面獲得病毒。犬作為伴侶動(dòng)物攜帶CPV對(duì)其他動(dòng)物造成潛在威脅。目前對(duì)于犬細(xì)小病毒病(CP)的預(yù)防主要依靠原始CPV-2毒株制備的疫苗,但由于病毒表面抗原易位容易導(dǎo)致免疫失敗。CPV感染犬的分子機(jī)制尚不明確,有必要對(duì)CPV的致病機(jī)理進(jìn)行深入的探討。己知CPV可以引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生病變,在體外可以誘導(dǎo)Hela,貓腎細(xì)胞F81和NLFK等細(xì)胞的凋亡,但這些細(xì)胞都不是伴侶動(dòng)物犬的細(xì)胞,本文為探究CPV在體外是否可以誘導(dǎo)犬腎細(xì)胞系MDCK宿主細(xì)胞的凋亡展開(kāi)試驗(yàn)。本試驗(yàn)首先根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的CPV序列設(shè)計(jì)7對(duì)引物,對(duì)CPV YBYJ株全基因組分段擴(kuò)增,克隆和測(cè)序,用DNAstar對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接,其全基因組包含5 051個(gè)核苷酸。與GeneBank中發(fā)表的其它犬細(xì)小病毒毒株進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化學(xué)分析,結(jié)果表明,CPV YBYJ株與亞洲地區(qū)的毒株的親緣關(guān)系最近,YBYJ 株與 CPV,SICHUAN(MH476590)的同源性最高,為 99%。與 GeneBank中發(fā)表的其它細(xì)小病毒毒株進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化學(xué)分析,結(jié)果表明,CPVYBYJ株與貓細(xì)小病毒(FPV)的親緣關(guān)系最近,基因組同源性是98.6%,與馬細(xì)小病毒(EqPV)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),基因組同源性?xún)H為35.1%。本試驗(yàn)應(yīng)用CPV YBYJ強(qiáng)毒株在體外感染MDCK宿主細(xì)胞,通過(guò)光學(xué)顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察到MDCK細(xì)胞被CPV感染后出現(xiàn)變圓、壞死和脫落等典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。隨著CPV感染時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞活性逐漸降低,具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。本試驗(yàn)成功建立CPV感染MDCK宿主細(xì)胞模型。通過(guò)細(xì)胞凋亡一DNA Ladder抽提試劑盒抽提CPV感染MDCK細(xì)胞的總DNA。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示明顯的DNA Ladder。熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察Annexin V-FITC/PI雙染法染色的樣品,CPV感染48 h時(shí),檢測(cè)孔內(nèi)有較多細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的蘋(píng)果綠色,部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色胞膜包裹著紅色的胞核。分別提取CPV誘導(dǎo)12 h,24 h,36h,48h和60h時(shí)MDCK細(xì)胞的蛋白,使用酶標(biāo)儀確定Caspase-3相對(duì)活性,Caspase-3活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低,并在48 h時(shí)達(dá)到峰值(p0.01)。但隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),凋亡作用活性檢測(cè)指標(biāo)逐漸減弱。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,CPV YBYJ強(qiáng)毒株在體外可以誘導(dǎo)MDCK宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)作用在感染48 h時(shí)最明顯,之后隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞趨于晚期凋亡并且壞死。本試驗(yàn)為后期研究CPV的分子生物學(xué)和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

１邋ＣＰＶ全基因組ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑提取病毒的核酸用７對(duì)特異性引物分段擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果逡逑顯示獲得與預(yù)期大小一致的片段（圖１）。逡逑Ｍ邋１邐２邐３邐４逡逑ｂｐ逡逑４００邋ｂｐ逡逑ｂｐ逡逑ｂｐ逡逑ｉ00邋ｂｐ逡逑４0邋ｂｐ邋ＥＳ＾逡逑２０邋ｂｐ逡逑圖１Ａ病毒基因組ＰＣＲ分段擴(kuò)增逡逑Ｍ：２０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ；邋１：３Ｙ１邋片段；２：３Ｙ２邋片段；３：５

株全長(zhǎng)為５邋０５１個(gè)核苷酸。將其與ＧｅｎＢａｎｋ中發(fā)表的其它細(xì)小病毒毒株進(jìn)行系統(tǒng)逡逑發(fā)育和同源性分析，結(jié)果表明，ＣＰＶ邋ＹＢＹＪ株與貓細(xì)小病毒（ＦＰＶ）的親緣關(guān)系逡逑最近（圖２），，基因組同源性是９８．６邋％邋（表４），與馬細(xì)小病毒（ＥｑＰＶ）的親緣關(guān)逡逑系最遠(yuǎn)，基因組同源性?xún)H為３５．１邋％。將其與ＧｅｎＢａｎｋ中發(fā)表的其它地區(qū)犬細(xì)小逡逑病毒毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析，結(jié)果表明，ＣＰＶ邋ＹＢＹＪ株與亞洲地區(qū)的毒逡逑株的親緣關(guān)系較近（圖３）
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S858.292

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673718