【摘要】：糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis,A.faecalis)是產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)的一類亞群。近些年來,有研究表明,該菌所含的胞外絲氨酸蛋白酶(Extracellular serine protease,Esp)對昆蟲的體壁具有溶解作用,特別是對線蟲具有毒殺作用,因此糞產(chǎn)堿桿菌被認為具有作為生物制劑的潛力。本研究從內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)自然放牧的羊群中采集硬蜱樣本,分離出可疑細菌,并采取常規(guī)方法和分子生物學方法對其進行種型鑒定及相關(guān)毒力因子的檢測與分析。具體研究內(nèi)容如下:1.A.faecalis IMH的分離與鑒定試驗蜱蟲經(jīng)研磨完全破碎后,沾取破碎組織液接種于LB高鹽瓊脂培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng),并通過革蘭氏染色及生理生化等常規(guī)試驗方法鑒定出一株A.faecalis,這與分子鑒定結(jié)果相吻合,該分離株菌的16S rRNA基因序列與GenBank上的糞產(chǎn)堿桿菌的相同基因的相似度為99%。根據(jù)16S rRNA基因繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹可看出,本試驗分離株與分離自墓土的Alcaligenes sp.CSB1(注冊號:KX289442.1)遺傳距離近,處在相同分支。本試驗成功分離出一株新的蜱源性糞產(chǎn)堿桿菌,命名為Alcaligenes faecalis IMH(簡稱為A.faecalis IMH),其16S rRNA基因注冊于GenBank中,注冊號為:LC213619.1。2.A.faecalis IMH的培養(yǎng)特性及生化試驗對A.faecalis IMH的溶血特性、藥物敏感性試驗分析結(jié)果表明,該分離株對綿羊血細胞有溶血現(xiàn)象,對慶大霉素、紅霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、環(huán)丙沙星敏感,但是對復方新諾明、卡那霉素、鏈霉素、青霉素、兩性霉素B呈現(xiàn)出耐藥性。另外,該分離株具有運動性并可在含有10%的NaCl的培養(yǎng)基中生長,呈現(xiàn)出高度耐鹽的特性。在糖類發(fā)酵試驗中,該分離株對蔗糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖等糖的分解試驗結(jié)果顯示陰性,并且吲哚試驗、硝酸鹽(還原)試驗、明膠液化試驗等結(jié)果仍顯示為陰性;而脲酶試驗、氧化型與發(fā)酵型試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗、氧化酶試驗結(jié)果則顯示為陽性。3.A.faecalis IMH對小鼠的致病性試驗A.faecalis IMH對小鼠致病性試驗結(jié)果顯示,腹腔注射高劑量菌液1.0×10~(11)CFU/mL的小鼠在感染約15 h后出現(xiàn)短暫性失明現(xiàn)象,小鼠表現(xiàn)出程度不同的精神抑郁,食欲減退,體溫、體重與對照組相比下降明顯,在注菌31 h后陸續(xù)有小鼠死亡;剖檢死亡的小鼠后主要的病理變化顯示,小腸出現(xiàn)黃色膠凍樣物質(zhì),脾臟腫大,腦部有萎縮現(xiàn)象。但是心臟、肝臟、肺臟無明顯病理變化。組織切片結(jié)果顯示,腦局部神經(jīng)細胞壞死明顯,腦膜出血,肝細胞中度腫脹,脾白髓內(nèi)可見淋巴細胞小灶性核崩解。但是心肌細胞無明顯變化。4.A.faecalis IMH的主要致病因子基因的克隆及相關(guān)分析對A.faecalis IMH的主要致病因子Esp蛋白質(zhì)進行預測分析。esp基因長度為2.8kbp,Esp是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì),其二級結(jié)構(gòu)預測以無規(guī)卷曲為主,占總結(jié)構(gòu)的48.97%,α-螺旋占22.26%、延伸鏈占22.48%、β-轉(zhuǎn)角占6.3%。對比A.faecalis IMH主要致病因子Esp和A.faecalis ZD02主要致病因子Esp兩種蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)不同之處,主要差異在96-98、106-111等處為α-螺旋;302-309處為β-折疊;213-219處為無規(guī)卷曲。A.faecalis IMH主要致病因子Esp結(jié)構(gòu)功能域預測顯示,在63-351位氨基酸為S8家族自轉(zhuǎn)運蛋白超家族和392-917位氨基酸為自身轉(zhuǎn)運蛋白超家族。
【圖文】：

4.1 細菌的分離和純培養(yǎng)結(jié)果在4% LB 高鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的分離菌，菌落呈灰白色、表面濕潤、半透明、略凸起，如圖1 所示。圖 1 分離菌菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of colony4.2 細菌形態(tài)特征觀察結(jié)果分離菌經(jīng)革蘭染色法染色后，經(jīng)顯微鏡油鏡觀察，分離菌為革蘭氏陰性短桿菌，排列方式為單個或成對排列，如圖2 所示。圖 2 分離菌染色形態(tài)特征(1000×)Fig.2 Morphological characteristics of gram strain(1000×)注：A：分離菌染色；B：金黃色葡萄球菌染色；C：大腸桿菌染色21

4.2 細菌形態(tài)特征觀察結(jié)果分離菌經(jīng)革蘭染色法染色后，，經(jīng)顯微鏡油鏡觀察，分離菌為革蘭氏陰性短桿菌，排列方式為單個或成對排列，如圖2 所示。圖 2 分離菌染色形態(tài)特征(1000×)Fig.2 Morphological characteristics of gram strain(1000×)注：A：分離菌染色；B：金黃色葡萄球菌染色；C：大腸桿菌染色21
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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本文編號：2673678