【摘要】：近年來,畜牧行業(yè)發(fā)展迅速,導致飼料資源越來越匱乏,人畜爭糧問題越來越嚴重,飼料資源已成為阻礙養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的一個重大問題。然而有一類主要成分為木質(zhì)纖維素的農(nóng)作物副產(chǎn)品資源十分豐富,但是這類含有木質(zhì)纖維素的植物,因其細胞壁難以降解,造成了自然界中大量的纖維素資源沒有在畜牧行業(yè)中得到廣泛應用,甚至造成環(huán)境污染。將木質(zhì)纖維素分解為可以被消化吸收的營養(yǎng)成分,依賴于纖維素酶系對底物的協(xié)同降解。本論文圍繞產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的篩選,纖維素酶基因的克隆,枯草芽孢桿菌信號肽的系統(tǒng)性篩選,纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶和木聚糖酶的分泌表達,以及多酶協(xié)同與多酶復合體協(xié)同降解天然纖維素效果進行了研究。結(jié)果如下:1采用剛果紅染色法從腐殖質(zhì)中分離獲得一株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌(Bacillus sp),經(jīng)革蘭氏染色和16s rDNA序列比對分析,分離獲得的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),將其命名為B.subtili ZC-5。B.subtili ZC-5培養(yǎng)24 h產(chǎn)酶活性最高達到3.22U/mL。B.subtili ZC-5的纖維素酶的最適反應溫度為50℃-60℃,最適pH為pH6-pH7。該酶不耐受高溫。不同纖維來源對B.subtili ZC-5產(chǎn)纖維素酶活力有影響,培養(yǎng)基中添加燕麥青干草時B.subtili ZC-5纖維素酶活最高(4.21U/mL)。2從B.subtili ZC-5基因組DNA中克隆獲得纖維素內(nèi)切酶基因cen ZC-5。cen ZC-5全長1.5 kb,編碼55個氨基酸,其編碼蛋白的N端30個氨基酸為信號肽。cen ZC-5的序列與Bacillus subtilis纖維素內(nèi)切酶基因序列的相似性達到94%,cen ZC-5編碼蛋白與Bacillus subtilis的纖維素內(nèi)切酶具有很高的相似性。在大腸桿菌中進行cen ZC-5原核表達,驗證了該基因編碼蛋白的纖維素酶活性。3構(gòu)建了E.coli-B.subtilis穿梭質(zhì)粒載體pCBS。基于pCBS和木聚糖酶基因xynBYG,分別構(gòu)建獲得信號肽篩選載體pP43-xynBYG和pPglvm-xynBYG。從B.subtilis1A747基因組中擴增獲得138個信號肽編碼基因,獲得114個信號肽篩選表達載體pGS-pGS 114、114個信號肽篩選表達載體pP43S1-pP43S114、24個信號肽篩選表達載體pGT1-pGT24和24個信號肽篩選表達載體pP43T1-pP43T24。以B.subtilis WB700為宿主進行276個信號肽介導的分泌表達檢測。結(jié)果顯示,信號肽Sec途徑信號肽PhoB、YhfM,YpjP和CotC展現(xiàn)了高分泌表達水平,木聚糖酶酶活高于150 U/mL。含Tat途徑信號肽的分泌表達重組菌中,信號肽LipA的酶活最高,大部分Tat途徑信號肽的酶活低于0.1 U/mL。4對信號肽的氨基酸殘基性質(zhì)和相應分泌表達量進行分析。結(jié)果顯示,氨基酸疏水性、螺旋傾向性指數(shù)、螺旋含量指數(shù)、側(cè)鏈θ角度指數(shù)、螺旋穩(wěn)定性指數(shù)、氨基酸殘基跨膜指數(shù)、雙氨基酸殘基轉(zhuǎn)角傾向指數(shù)和信號肽D-score等指標和分泌表達量呈強相關性。LPS分析顯示,7個氨基酸指數(shù)和信號肽D-score對分泌表達量變異的貢獻率為23%,其中螺旋傾向性指數(shù),氨基酸殘基跨膜指數(shù)和D-score是3個重要的獨立變量。采用同樣的分析方法分析這8個變量(7個氨基酸指數(shù)和信號肽D-score)和角質(zhì)酶分泌表達的關系。結(jié)果顯示,這8個變量對角質(zhì)酶分泌表達量變異的貢獻率為18%,氨基酸殘基跨膜指數(shù)和D-score是2個重要的獨立變量。PLS預測的模型和木聚糖酶表達量的測定值之間具有強相關性(PCC=0.54)。5構(gòu)建了含自身信號肽的cen ZC-5分泌表達載體pCEN,phoB介導的cen ZC-5分泌表達載體pPhoB-CEN。合成Clostridium thermocellum多酶復合體中纖維素酶組分的錨定域蛋白(Dockerin)的編碼基因Ctdoc,構(gòu)建3’端嵌合Ctdoccen的重組基因cenZC-5doc,并構(gòu)建了cenZC-5doc分泌表達載體pCENdoc。分泌表達檢測顯示,在12h、24h、36h和48h,B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的分泌表達水平依次是WB700(pCEN)的1.56、1.44、1.37和1.25倍。B.subtilis WB700(pCendoc)在24h和36h的分泌表達水平依次是B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的84.68%和8427%。6合成嵌合了Clostridium cellulolyticum纖維素Dockerin的編碼基因Ccdoc的重組纖維素外切酶cbhAdoc,并構(gòu)建分泌表達載體pCBdoc。構(gòu)建嵌合了Rumincoccus flavefaciens Dockerin的編碼基因Rfdoc的重組木聚糖酶xyn BYGdoc,并構(gòu)建分泌表達載體pXYNdoc。設計合成含Clostridium thermocellum纖維素結(jié)合域(CBM)和粘附域(Cohesin),Clostridium cellulolyticum Cohesin和Rumincoccus flavefaciens Cohesin的腳手架蛋白(Scaffoldin)基因scafCCR,并構(gòu)建分泌表達載體pScaf。分泌表達檢測顯示,cbhAdoc在B.subtilis WB700中的分泌表達水平在24h達到最大為1.59U/mL。重組木聚糖酶Xyn BYGdoc在24h的分泌表達水平達到最大為302.11U/mL。在24h和48h,重組木聚糖酶(xyn BYGdoc)的分泌表達量為木聚糖酶(xyn BYG)的81.56%和76.24%。7為檢測不同酶協(xié)同降解效果,采用B.subtilis WB700分泌表達的CenZC-5doc和CbhAdoc共同處理燕麥青干草時,在24h、48h和72h還原糖的產(chǎn)量均高于CenZC-5doc或CbhAdoc單獨處理燕麥青干草。采用B.subtilis WB700分泌表達CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解燕麥青干草2h、48h和72h,還原糖的產(chǎn)量顯著的高于CenZC-5doc和CbhAdoc共同降解燕麥青干草的還原糖產(chǎn)量。CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解24h、48h和72h的還原糖的產(chǎn)量分別是是CenZC-5doc和CbhAdoc雙酶共同降解的1.38倍、1.42倍和1.17倍。純化B.subtilis WB700分泌表達CenZC-5doc,CbhAdoc,Xyn BYGdoc和ScafCCR,在體外孵育組裝多酶復合體,多酶復合體降解燕麥青干草產(chǎn)生的還原糖量在24h、48h和72h均高于CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc的3酶混合物共同降解產(chǎn)生的還原糖量。
【圖文】：

圖 1-1 纖維素多酶復合體示意圖Fig1-1 Modular architecture of the cellulosomeCellulosome 的優(yōu)勢不僅在于多酶系的聚集復，該復合體還會發(fā)生動態(tài)聚合。早 年就通過 TEM 發(fā)現(xiàn)在用非溶性纖維素培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素酶多酶復合體能夠聚合徑為 60～200nm 的多聚 Cellulosome (Bayer et al. 1998)。在形成多聚 Cellulosome兩個不同類型的 Cellulosome 能夠形成二聚體。分析 Cellulosome 結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)losome 能夠通過其 Scaffold 蛋白 I 型 cohesin 與其他 Cellulosome 的 Scaffold 蛋

（Cohesin-Dockerin）相互作用形成的。Cohesin-Dockerin相互作用將纖維素酶分子結(jié)合到Scaffold上，并且可以通過不同Scaffold的Cohesin-Dockerin相互作用，連接組裝成更加復雜的Cellulosome（圖1-2）。Cellulosome可以通過Cohesin-Dockerin特定相互作用將Cellulosome連接到細胞表面（圖1-3），從而將多個酶分子組裝成復合體(Tokatlidis et al. 1991; Tokatlidis et al. 1993; Salamitou et al. 1992)。人們很早以前對熱纖梭菌中纖維素酶多酶復合體進行生化分析時，發(fā)現(xiàn)存在一種異常強烈的蛋白相互作用(Fierobe et al. 1999)。后續(xù)分析證實粘附蛋白與錨定蛋白的相互作用的確是高親和性的相互作用，據(jù)估計，解離常數(shù)(KD)約為10-9-10-12mol/L，或者更低(Fierobe et al.2001; Mechalyet al. 2001; Yaron et al. 1995; Lytle et al. 2000)。圖1-2 多聚Cellulosome示意圖Fig1-2 Heterodimeric CellulosomeCellulosome中Scaffold的粘附蛋白（Cohesin）通常成串排列，在Cellulosome的組裝中發(fā)揮重要作用。Scaffold的Cohesin數(shù)量在1-11個之間，，通常情況下都大于4個(Doi et al.2004)。來源于C. thermocellum的Cellulosome，Scaffold包含九個相似的Cohesin
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S816

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本文編號：2672650