【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)所引發(fā)的一種急性、熱性和致死性傳染病。豬瘟標記疫苗(Marker Vaccine)具有區(qū)別豬瘟疫苗免疫抗體和野毒感染抗體的特點,可以用于凈化及緊急免疫。近年來,陸續(xù)有國內(nèi)外研究者應(yīng)用分子生物學(xué)和基因工程方法,對豬瘟野毒或弱毒進行基因修飾構(gòu)建出新毒株,其中以Erns和E2為基礎(chǔ)構(gòu)建新毒株的方法在豬瘟標記疫苗的研究中占據(jù)著重要地位。WH303單克隆抗體表位為線性表位,位于豬瘟的E2蛋白,突變后不能與相應(yīng)的單克隆抗體反應(yīng),豬瘟C株為我國研發(fā)的具有良好安全性和免疫保護效果的疫苗毒株。故本研究在豬瘟兔化弱毒C株的基礎(chǔ)上突變WH303表位構(gòu)建豬瘟標記疫苗候選毒株。本研究通過自行設(shè)計引物IVDC582、IVDC583,運用重疊PCR的方法,擴增出了包含WH303最小識別序列在內(nèi)的2047bp大小的片段;然后將該片段連接至T載體,得到MT-582583;再以限制酶SnaBI和NgoMIV酶切連接至實驗室構(gòu)建的質(zhì)粒pMD18-T-NotI-BamHI和pMD18-T-NotIBamHI-flag;最后用限制酶NotI和BamHI酶切連接至C株和C-flag株的感染性克隆,從而完成突變毒株MC與MC-flag的感染性克隆構(gòu)建。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成病毒RNA,利用電轉(zhuǎn)的方法將MC株電轉(zhuǎn)至PK15細胞,連續(xù)傳代,使用單抗WH303和1C8對病毒液進行免疫組化染色,以確定MC株是否成功拯救。兔體接種C株和MC株,觀測兔子體溫變化情況。體溫達到峰值時,對兔進行安樂死,取脾臟和其他主要器官,進行RT-PCR檢測和測序,同時制備組織切片,通過免疫組化來確定MC株在兔體的增殖情況。在3d、7d、14d和21d四個時間段取兔全血,制備血清,進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),檢測血清中抗體含量。通過重疊PCR的操作方法,成功篩選出M-297300陽性克隆;將M-297300連接至T載體得到MT-582583;通過酶切連接操作,成功構(gòu)建出了pMD18-T-NotI-BamHI-582583M和pMD18-TNotI-BamHI-flag-582583M陽性質(zhì)粒;再次酶切連接,最終構(gòu)建成功了MC和MC-flag感染性克隆并拯救出了病毒株。在病毒MC傳代的過程中免疫組化結(jié)果顯示,在48h后、第六代和第十二代以單抗1C8進行免疫組化染色均為陽性,WH303染色為陰性,表明病毒成功拯救并穩(wěn)定傳代。MC株在兔體內(nèi)傳三代,MC接種兔體結(jié)果顯示,在前兩代中兔體發(fā)熱情況不明顯,第三代基本呈定型熱反應(yīng)。RT-PCR結(jié)果顯示在第一代4只兔子中,只有一只出現(xiàn)目的條帶,第二代和第三代全部出現(xiàn)目的條帶,且測序結(jié)果均顯示與引物IVDC582、IVDC583一致,說明在兔體傳代的過程中突變毒株MC保持基因穩(wěn)定。組織切片免疫組化染色的結(jié)果顯示MC在脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)含量明顯高于其他組織。接種MC株的兔血清阻斷ELISA抗體檢測結(jié)果為陰性,說明血清中沒有特異性識別WH303位點的抗體;間接ELISA抗體檢測結(jié)果為陽性,說明血清中存在豬瘟特異性抗體。本研究在C株的基礎(chǔ)上突變WH303位點,在一定程度上避免了由強毒回復(fù)突變造成的生物安全隱患,而且突變毒株可以保持兔化弱毒C株的基本特性。再輔以后續(xù)研究的鑒別診斷方法,有望成為豬瘟標記疫苗。
【圖文】：

flag-582583M 和 pMD18-T-NotI-BamHI-582583M，分別連接至 C-flag 株全長和 C 株全長，通過PCR 和酶切驗證的方法最終分別篩選出 csfull-flag-582583M 和 csfull-582583M 陽性克隆即 MC-flag 和 MC 感染性克隆。1.5.2 突變毒株的拯救和細胞傳代將 MC 感染性克隆以限制酶 SwaI 線性化，體外轉(zhuǎn)錄成 RNA，去除 RNA 酶后，用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染至 PK15 細胞，并連續(xù)傳代，通過過免疫氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）和間接免疫熒光染色的方法鑒定是否成功將突變感染性克隆的 RNA 導(dǎo)入 PK15 細胞并復(fù)制出病毒。1.5.3 MC 株在兔體中的傳代及免疫抗體檢測主要進行兔體實驗。將培養(yǎng)的細胞突變毒 MC 株與 C 株進行兔體接種，然后觀測兔體溫變化，待兔體溫上升至峰值時對兔安樂死，采取心、肝、脾、肺、腎和下頜淋巴結(jié)等組織，，制備組織切片并保存脾毒。分別用單抗 WH303 和 1C8 對脾臟組織切片進行免疫組化染色，通過染色結(jié)果進一步確定 MC 株是否成功完成 WH303 位點的突變并保持穩(wěn)定，同時通過分析其他組織免疫組結(jié)果強陽性率來分析 MC 株在兔體各個組織的分布規(guī)律。C 株與 MC 株接種兔體過程中，在3d、7d、14d 和 21d 四個時間段采取全血，制備血清，進行阻斷 ELISA 和間接 ELISA 抗體檢測來分析特異性識別 WH303 表位單抗和豬瘟抗體的水平。

獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文 第二章 MC 和 MC-fladdH2O 7.8μL37℃酶切 1h。（2）將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，看是否產(chǎn)生目的大小條帶。SacIbp、3800bp、2600bp 和 1300bp 大小片段。BamHI 和 NotI 雙酶切應(yīng)出現(xiàn)約 片段。.3.4 PCR 產(chǎn)物測序在菌落 PCR 大小驗證和質(zhì)粒酶切驗證都正確之后，將引物 IVDC 297、IVD送測序，得到的測序結(jié)果與引物 IVDC 582、IVDC 583 進行序列比對，看是突變的 WH303 位點是否穩(wěn)定。 試驗結(jié)果.1 297-582、583-300PCR 和重疊 PCR 結(jié)果297-582PCR 結(jié)果為 472bp 大小片段；583-300PCR 結(jié)果為 1617bp 大小片段 結(jié)果為 2047bp 大小片段。電泳結(jié)果如下圖，均與預(yù)測結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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5 郭沛;王霄e

本文編號：2670999