發(fā)布時(shí)間：2020-05-18 15:49

【摘要】：(1)利用TALENs/CRISPR技術(shù)制備NLRP3基因修飾豬背景:轉(zhuǎn)基因抗病豬、高品質(zhì)豬等擁有巨大的經(jīng)濟(jì)前景和社會(huì)效益。因?yàn)樨i的胚胎干細(xì)胞系尚未建立,所以常用的方法是將體細(xì)胞基因修飾與體細(xì)胞核移植技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生克隆豬。但是由于體細(xì)胞的擴(kuò)增代數(shù)有限,且體細(xì)胞打靶效率較低,定點(diǎn)基因修飾豬的推廣受到限制。ZFN、TALENs和CRISPR技術(shù)的相繼誕生使得基因定點(diǎn)敲除變得更為高效。人類NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)基因第260位氨基酸發(fā)生錯(cuò)意突變(R260W)會(huì)導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活而產(chǎn)生自身炎癥性疾病。小鼠、豬在人類NLRP3 R260W基因致病突變位點(diǎn)的是保守的,小鼠對(duì)應(yīng)氨基酸突變位點(diǎn)為R258W,豬對(duì)應(yīng)氨基酸突變位點(diǎn)為R259W。在小鼠R258W突變的模型中,NLRP3炎癥小體的活化并未表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),而是導(dǎo)致其抗病力增強(qiáng)。提示我們通過在豬上模擬NLRP3基因的相同突變可能制備出抗病能力增強(qiáng)的克隆豬。此外,我們擬同時(shí)制備NLRP3基因敲除豬模型,通過對(duì)比NLRP3基因敲除豬和定點(diǎn)突變豬的各項(xiàng)生理指標(biāo)差異,共同作為NLRP3炎性體相關(guān)疾病機(jī)理的大型動(dòng)物模型。方法:我們分別利用TALENs、CRISPR基因修飾技術(shù),在豬成纖維細(xì)胞上分別篩選出基因編輯活性較高的TALENs組合以及gRNA位點(diǎn),然后分別將TALENs、CRISPR基因修飾技術(shù)與同源重組技術(shù)相結(jié)合,用于制備NLRP3基因修飾的豬成纖維細(xì)胞系。然后再結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)(SCNT),將重組胚胎體外培養(yǎng)后移植到受體母豬中,用于制備NLRP3敲除/定點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)基因豬。結(jié)果:我們構(gòu)建出針對(duì)豬NLRP3基因的TALENs打靶載體,以及用作同源重組模板的單鏈DNA(ssDNA),并篩選出活性最高的TALENs組合;同時(shí)構(gòu)建了針對(duì)豬NLRP3基因的CRISPR基因編輯系統(tǒng)打靶載體,以及相應(yīng)的ssDNA。我們利用CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù),獲得了 10株NLRP3敲除的豬成纖維細(xì)胞系。我們利用CRISPR/Cpf1基因修飾技術(shù)結(jié)合同源重組技術(shù),獲得了 3株NLRP3定點(diǎn)突變的豬成纖維細(xì)胞系。我們將獲得的NLRP3敲除/定點(diǎn)突變的豬成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞,通過體細(xì)胞核移植技術(shù)和胚胎移植技術(shù),成功獲得了 28頭NLRP3R259W純合突變的克隆豬,1頭NLRP3基因雙拷貝敲除13bp的克隆豬。結(jié)論:我們模擬人自然發(fā)生的NLRP3基因突變,結(jié)合TALENs/CRISPR基因定點(diǎn)敲除技術(shù)、同源重組技術(shù)以及體細(xì)胞核移植技術(shù),成功制備了 NLRP3基因修飾的克隆豬,以供進(jìn)一步的研究。(2)RYR2突變的iPSCs建立和初步分化背景:誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的出現(xiàn)為疾病模型的建立提供了新的思路。由于可以從患者自身的很多易得的細(xì)胞來源(例如尿液、皮膚成纖維細(xì)胞)誘導(dǎo),且具有與胚胎干細(xì)胞相似的多能性,因此hiPSCs可用于建立個(gè)性化疾病模型,且不存在倫理問題,大大拓展了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的范圍。兒茶酚胺多形性室性心動(dòng)過速Ⅰ型(CPVT1)是一種由蘭尼堿受體2型基因(RYR2)單基因突變導(dǎo)致的遺傳性心臟病。RYR2基因突變導(dǎo)致了心臟功能的紊亂,以應(yīng)激誘發(fā)的室性心律失常為特征,每年會(huì)導(dǎo)致大量年輕人猝死。因此,建立RYR2單基因突變導(dǎo)致的遺傳性心臟病iPSCs并將其分化成心肌細(xì)胞,對(duì)于研究疾病機(jī)理,進(jìn)行藥物篩選等方面具有重要意義。方法:本研究利用慢病毒系統(tǒng)將Yamanaka四因子(Oct4、Sox2、Klf4和Nanog)整合到兒茶酚胺多形性室性心動(dòng)過速I型(CPVT1)患者的皮膚成纖維細(xì)胞中,將其誘導(dǎo)成為iPSCs,并通過形態(tài),表面抗原,基因表達(dá),多能細(xì)胞特異性基因的表觀遺傳狀態(tài)等方面驗(yàn)證其多能性。然后,再將iPSCs在體外定向分化成心肌細(xì)胞,并鑒定心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況,從而初步建立RYR2單基因突變導(dǎo)致的遺傳性心臟病模型。結(jié)果:我們鑒定了一名兒茶酚胺多形性室性心動(dòng)過速I型(CPVT1)患者的基因型特征,從該患者皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出了 2株hiPSCs。通過對(duì)獲得的hiPSCs干細(xì)胞標(biāo)記物染色,可見其表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿性磷酸酶活性,且表達(dá)Oct4和Nanog以及胚胎干細(xì)胞細(xì)胞特異性表面抗原,包括階段特異性胚胎抗原-3(SSEA3),階段特異性胚胎抗原-4(SSEA4),腫瘤相關(guān)抗原TRA-1-60,TRA-1-81。通過對(duì)hiPSCs的Oct4基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了去甲基化程度分析,確認(rèn)2株hiPSCs,即iPS-2和iPS-4的Oct4基因啟動(dòng)子區(qū)域均被很大程度地去甲基化。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)hiPSCs中多能性基因的表達(dá)量顯著高于成纖維細(xì)胞(P0.01)。通過采用RT-PCR方法,發(fā)現(xiàn)hiPSCs分化得到的擬胚體(EB)的三個(gè)胚層標(biāo)志基因的表達(dá)量是hiPSCs的5～50倍,證明hiPSCs具有在體外分化成三個(gè)胚層的潛能。通過將hiPSCs接種非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠獲得的畸胎瘤切片進(jìn)行HE染色,證明hiPSCs具有在體內(nèi)分化成三個(gè)胚層的潛力。我們還通過聯(lián)重復(fù)技術(shù)(STR)檢測(cè)確定了 iPS細(xì)胞為單一細(xì)胞來源,不存在交叉污染現(xiàn)象。以上證明我們誘導(dǎo)得到的hiPSCs具有很高的多能性。然后我們對(duì)RYR2 iPSCs進(jìn)行了定向誘導(dǎo)分化,分化11天后可以觀察到細(xì)胞有自發(fā)的跳動(dòng)簇。我們采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)跳動(dòng)的細(xì)胞中心肌發(fā)育相關(guān)的早期基因的表達(dá)量為hiPSCs的20～40倍。結(jié)論:我們成功誘導(dǎo)了兒茶酚胺多形性室性心動(dòng)過速I型(CPVT1)患者特異性iPS細(xì)胞系2株,并證明其具有很強(qiáng)的多能性。我們初步將iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化,可以觀察到心肌細(xì)胞有節(jié)律收縮現(xiàn)象,并高表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物。但由于本研究處于初步探索階段,心肌分化方案尚需完善,功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)尚未涉及,有待進(jìn)行進(jìn)一步研究。
【圖文】：

這種精子介導(dǎo)的ＤＮＡ轉(zhuǎn)移（ＳＭＧＴ）聯(lián)合胞質(zhì)內(nèi)精子注射（ＩＣＳＩ）的效率逡逑相對(duì)較高，并且允許插入大的ＤＮＡ片段。逡逑這種方法依賴于被遺傳修飾的生殖細(xì)胞移植干細(xì)胞（ＧＳＣｓ）的能力體外定殖逡逑受體睪丸并在移植后產(chǎn)生供體來源的精子。ＧＳＣ介導(dǎo)的生殖細(xì)胞修飾避免了與胚逡逑胎相關(guān)的問題操縱和細(xì)胞核重新編程。但因?yàn)樯臣?xì)胞移植干細(xì)胞（ＧＳＣｓ）難以逡逑在體外培養(yǎng)，，所以有針對(duì)性的突變使用ＧＳＣｓ的動(dòng)物仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)Ｉ４＇逡逑１．３．２基因修飾方式逡逑基因編輯工程酶可以在特定基因的目標(biāo)位點(diǎn)引入一個(gè)雙鏈斷裂（ＤＳＢ），使基逡逑因發(fā)生插入或缺失。一方面可以通過非同源末端連接（ＮＨＥｊ）修復(fù)引入突變，另逡逑－方面也可以通過同源性定向修復(fù)（ＨＤＲ）外源同源ＤＮＡ片段來實(shí)現(xiàn)靶向序列替逡逑換。逡逑

圖２豬原代胚胎成纖維細(xì)胞逡逑纖維細(xì)胞的ＮＬＲＰ３基因序列逡逑ＢＩ查找的ＮＬＲＰ３序列（Ｇｅｎｅ邋ＩＤ：邋１００５１４８２３），分別將鼠的ＮＬＲＰ３基因進(jìn)行對(duì)比。確認(rèn)以上三個(gè)物種在目。逡逑ｐｒｏｃｅｍ．邋ｐｒｏ邋W涵曍帊shｇｇｓＥ？ｇＹＣ￡？謹(jǐn)團(tuán)涵邋ｇ逡逑３ｐｒｃ＾ｅｉｎ．ｐｒｏｐｒｏｔ：ｅｉｎ．邋ｐｒｏ邐ｉＢＨ雨ｉｗＪｇＫ邋［ｄＳＢＳＢｒＨＳ邋５逡逑Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ邋ｊｅｐｖｈｃｖｖｆｑｇａａｇｉｇｋ＾ｉｉａｒＪｃ邋ｒｒｌｄｗａ邋１邋ｆｄｙｌｆ邋ｉｈｃｒ－人類、小鼠和豬的ＮＬＲＰ３基因的目的位點(diǎn)的保守性分顯示第２５９位精氨酸（Ｒ）所在區(qū)域在三個(gè)物種中是上下游設(shè)計(jì)鑒定引物，以擬用于打靶的本實(shí)驗(yàn)室制備為模板進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與ＮＣＢＩ上提供的
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828;Q78

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6 喻t熑

本文編號(hào)：2669951