【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies,PR),又稱Aujeszky氏病,是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以母豬出現(xiàn)繁殖障礙,仔豬出現(xiàn)呼吸和神經癥狀為特征的一種急性傳染病。長期以來,我國的養(yǎng)豬場采用弱毒疫苗免疫接種,使該病得到了有效控制。但2011年以來,我國多個免疫過Bartha-K61疫苗的規(guī)�；i場相繼出現(xiàn)了變異PRV疫情,造成母豬流產和仔豬死亡率升高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。然而當前流行的變異毒株與經典毒株間的遺傳差異以及變異毒株的重要毒力基因的特性與功能尚不清楚。在本研究中,我們對一株國內經典PRV SC株和一株變異HLJ8株進行了全基因組的測序,獲得了兩株病毒的全基因組序列信息。通過與數據庫現(xiàn)有的PRV全基因組序列和PRV gC基因序列一起進行基因組比對和系統(tǒng)進化分析,我們證明來自不同地理區(qū)域的PRV毒株表現(xiàn)出不同的進化趨勢,特別是我國的早期分離株和當前的變異株組成了新的基因亞型。此外通過重組和系統(tǒng)發(fā)育分析,我們首次報道了發(fā)生在PRV毒株之間的重組事件,并表明SC株是國內PRV早期毒株和Bartha疫苗樣毒株的自然重組株。UL41是α皰疹病毒的保守蛋白,單純皰疹病毒Ⅰ型的研究表明其具有RNase活性,是病毒感染時重要的調控蛋白。為研究PRV UL41在病毒致病過程中的功能,本文利用體外同源重組技術將UL41上下游序列和eGFP序列連接到線性載體上獲得供體質粒。將質粒連同PRV基因組共轉染到Vero細胞中,通過篩選產生熒光病變的病毒獲得△UL41 eGFP PRV;然后構建只包含UL41上下游序列的供體質粒及包含UL41編碼框和HA標簽的供體質粒,同時構建剪切eGFP序列的CRISPR/Cas9質粒,一并與△UL41 eGFP PRV基因組共轉染Vero,通過細胞病變熒光的有無及PCR篩選得到UL41缺失和回復型PRV。UL41缺失后PRV在Vero細胞上的病毒蝕斑和滴度均比親本顯著減小,表明缺失病毒的復制和擴散能力下降;但在PK-15和MDBK細胞上的滴度與親本類似,表明UL41缺失只能導致病毒在特異的細胞系中復制能力受損。而且UL41缺失使病毒對小鼠的致死率和神經侵襲能力均顯著下降。熒光素酶報告實驗表明SC株和JS-2012株UL41的宿主關閉活性有差異,SC株的UL41有更顯著的活性。進一步qRT-PCR表明UL41缺失與否,PRV變異株都能使宿主基因表達下降,表明病毒其他因子可能參與對宿主早期的關閉。PRV的UL24同源基因在皰疹病毒中也很保守。其他α皰疹病毒的研究表明UL24是重要的毒力決定因子,而目前還未見對PRV UL24基因的研究。本研究對PRV UL24基因的特性與功能進行了研究。首先UL24基因的mRNA在PRV感染細胞8 h后才能被檢測到,同時PAA能顯著抑制其轉錄,表明UL24是PRV的晚期基因。進一步UL24蛋白在病毒感染12 h時被檢測到,表明UL24基因可以編碼蛋白從而發(fā)揮功能。異源表達的UL24可以定位到細胞核中,提示其可能在病毒感染時入核。此外本文利用CRISPR/Cas9技術構建了UL24缺失、TK缺失及UL24和TK雙缺失的PRVs。TK或UL24缺失毒株均能在Vero細胞上復制,但在復制晚期各缺失株的病毒毒價會顯著低于親本,各缺失病毒蝕斑也顯著小于親本。體內特性分析表明UL24缺失會導致病毒對小鼠的致病力減弱;而TK缺失后病毒對小鼠喪失致病性。而且在TK缺失株感染小鼠三叉神經沒有感染性病毒,但是有病毒基因組存在,表明TK缺失病毒可以侵入三叉神經但是喪失感染能力。此外UL24缺失病毒感染細胞IFN-β的表達量顯著升高,表明UL24蛋白能夠參與抑制IFN-β表達。熒光素酶報告實驗表明UL24蛋白能夠通過抑制cGAS-STING激活的NF-κB途徑來對IFN-β表達進行調控。不過,UL24調控IFN-β表達的深入機制還需要進一步的研究來證明。綜上所述,本研究通過全基因組水平的測序與比較分析發(fā)現(xiàn)國內經典PRV SC株基因組的部分序列與Bartha高度同源,表明其是國內株與Bartha疫苗株的潛在重組株。通過對病毒毒力相關蛋白UL41和UL24特性進行研究發(fā)現(xiàn)UL41缺失使PRV在體內外的復制和感染力均下降,而且變異株的UL41蛋白由于存在氨基酸的突變,其vhs活性較經典株顯著減弱;而UL24缺失能使PRV在體內外的復制和感染力均降低,而且UL24蛋白能夠抑制cGAS-STING激活的NF-κB途徑對IFN-β表達進行調控。
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3圖 1.2 偽狂犬病病毒粒子的結構特征(引自 Pomeranz et al., 2005)Fig. 1.2 Structure of the PRV virion (adapted from Pomeranz et al., 200

圖 1.3 RNA 引導的 Cas9 核酸酶的工作示意圖(引自 Ran et al., 2013)Fig. 1.3 Schematic of the RNA-guided Cas9 nuclease (adapted from Ran et al., 2013)as9 核酸酶來自化膿性鏈球菌（以黃色表示），其通過 20-nt 指導序列（藍色）組成的（紅色）靶向基因組 DNA；指導序列與目標 DNA 序列（藍色條）配對，，并直接位于G 的上游（PAM；粉紅色）。 然后 Cas9 介導 PAM 上游約 3bp 的特異性切割（紅色三
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 彭金美;安同慶;趙鴻遠;劉益民;陳家锃;冷超糧;孫艷;常丹;田志軍;童光志;;豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J];中國預防獸醫(yī)學報;2013年01期

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3 袁慶志;禮卓然;南錫;吳裕祥;李亞香;;豬偽狂犬病病毒的分離與鑒定[J];中國畜禽傳染病;1987年03期

相關碩士學位論文 前1條

1 葉超;豬偽狂犬病病毒HeN1株全基因組測序與病毒遺傳變異分析[D];中國農業(yè)科學院;2015年

本文編號：2666313