【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies,PR),又稱Aujeszky氏病,是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以母豬出現(xiàn)繁殖障礙,仔豬出現(xiàn)呼吸和神經(jīng)癥狀為特征的一種急性傳染病。長(zhǎng)期以來,我國(guó)的養(yǎng)豬場(chǎng)采用弱毒疫苗免疫接種,使該病得到了有效控制。但2011年以來,我國(guó)多個(gè)免疫過Bartha-K61疫苗的規(guī)�；i場(chǎng)相繼出現(xiàn)了變異PRV疫情,造成母豬流產(chǎn)和仔豬死亡率升高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。然而當(dāng)前流行的變異毒株與經(jīng)典毒株間的遺傳差異以及變異毒株的重要毒力基因的特性與功能尚不清楚。在本研究中,我們對(duì)一株國(guó)內(nèi)經(jīng)典PRV SC株和一株變異HLJ8株進(jìn)行了全基因組的測(cè)序,獲得了兩株病毒的全基因組序列信息。通過與數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的PRV全基因組序列和PRV gC基因序列一起進(jìn)行基因組比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析,我們證明來自不同地理區(qū)域的PRV毒株表現(xiàn)出不同的進(jìn)化趨勢(shì),特別是我國(guó)的早期分離株和當(dāng)前的變異株組成了新的基因亞型。此外通過重組和系統(tǒng)發(fā)育分析,我們首次報(bào)道了發(fā)生在PRV毒株之間的重組事件,并表明SC株是國(guó)內(nèi)PRV早期毒株和Bartha疫苗樣毒株的自然重組株。UL41是α皰疹病毒的保守蛋白,單純皰疹病毒Ⅰ型的研究表明其具有RNase活性,是病毒感染時(shí)重要的調(diào)控蛋白。為研究PRV UL41在病毒致病過程中的功能,本文利用體外同源重組技術(shù)將UL41上下游序列和eGFP序列連接到線性載體上獲得供體質(zhì)粒。將質(zhì)粒連同PRV基因組共轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中,通過篩選產(chǎn)生熒光病變的病毒獲得△UL41 eGFP PRV;然后構(gòu)建只包含UL41上下游序列的供體質(zhì)粒及包含UL41編碼框和HA標(biāo)簽的供體質(zhì)粒,同時(shí)構(gòu)建剪切eGFP序列的CRISPR/Cas9質(zhì)粒,一并與△UL41 eGFP PRV基因組共轉(zhuǎn)染Vero,通過細(xì)胞病變熒光的有無及PCR篩選得到UL41缺失和回復(fù)型PRV。UL41缺失后PRV在Vero細(xì)胞上的病毒蝕斑和滴度均比親本顯著減小,表明缺失病毒的復(fù)制和擴(kuò)散能力下降;但在PK-15和MDBK細(xì)胞上的滴度與親本類似,表明UL41缺失只能導(dǎo)致病毒在特異的細(xì)胞系中復(fù)制能力受損。而且UL41缺失使病毒對(duì)小鼠的致死率和神經(jīng)侵襲能力均顯著下降。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明SC株和JS-2012株UL41的宿主關(guān)閉活性有差異,SC株的UL41有更顯著的活性。進(jìn)一步qRT-PCR表明UL41缺失與否,PRV變異株都能使宿主基因表達(dá)下降,表明病毒其他因子可能參與對(duì)宿主早期的關(guān)閉。PRV的UL24同源基因在皰疹病毒中也很保守。其他α皰疹病毒的研究表明UL24是重要的毒力決定因子,而目前還未見對(duì)PRV UL24基因的研究。本研究對(duì)PRV UL24基因的特性與功能進(jìn)行了研究。首先UL24基因的mRNA在PRV感染細(xì)胞8 h后才能被檢測(cè)到,同時(shí)PAA能顯著抑制其轉(zhuǎn)錄,表明UL24是PRV的晚期基因。進(jìn)一步UL24蛋白在病毒感染12 h時(shí)被檢測(cè)到,表明UL24基因可以編碼蛋白從而發(fā)揮功能。異源表達(dá)的UL24可以定位到細(xì)胞核中,提示其可能在病毒感染時(shí)入核。此外本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了UL24缺失、TK缺失及UL24和TK雙缺失的PRVs。TK或UL24缺失毒株均能在Vero細(xì)胞上復(fù)制,但在復(fù)制晚期各缺失株的病毒毒價(jià)會(huì)顯著低于親本,各缺失病毒蝕斑也顯著小于親本。體內(nèi)特性分析表明UL24缺失會(huì)導(dǎo)致病毒對(duì)小鼠的致病力減弱;而TK缺失后病毒對(duì)小鼠喪失致病性。而且在TK缺失株感染小鼠三叉神經(jīng)沒有感染性病毒,但是有病毒基因組存在,表明TK缺失病毒可以侵入三叉神經(jīng)但是喪失感染能力。此外UL24缺失病毒感染細(xì)胞IFN-β的表達(dá)量顯著升高,表明UL24蛋白能夠參與抑制IFN-β表達(dá)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明UL24蛋白能夠通過抑制cGAS-STING激活的NF-κB途徑來對(duì)IFN-β表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。不過,UL24調(diào)控IFN-β表達(dá)的深入機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來證明。綜上所述,本研究通過全基因組水平的測(cè)序與比較分析發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)經(jīng)典PRV SC株基因組的部分序列與Bartha高度同源,表明其是國(guó)內(nèi)株與Bartha疫苗株的潛在重組株。通過對(duì)病毒毒力相關(guān)蛋白UL41和UL24特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)UL41缺失使PRV在體內(nèi)外的復(fù)制和感染力均下降,而且變異株的UL41蛋白由于存在氨基酸的突變,其vhs活性較經(jīng)典株顯著減弱;而UL24缺失能使PRV在體內(nèi)外的復(fù)制和感染力均降低,而且UL24蛋白能夠抑制cGAS-STING激活的NF-κB途徑對(duì)IFN-β表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
【圖文】：

3圖 1.2 偽狂犬病病毒粒子的結(jié)構(gòu)特征(引自 Pomeranz et al., 2005)Fig. 1.2 Structure of the PRV virion (adapted from Pomeranz et al., 200

圖 1.3 RNA 引導(dǎo)的 Cas9 核酸酶的工作示意圖(引自 Ran et al., 2013)Fig. 1.3 Schematic of the RNA-guided Cas9 nuclease (adapted from Ran et al., 2013)as9 核酸酶來自化膿性鏈球菌（以黃色表示），其通過 20-nt 指導(dǎo)序列（藍(lán)色）組成的（紅色）靶向基因組 DNA；指導(dǎo)序列與目標(biāo) DNA 序列（藍(lán)色條）配對(duì)，，并直接位于G 的上游（PAM；粉紅色）。 然后 Cas9 介導(dǎo) PAM 上游約 3bp 的特異性切割（紅色三
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 彭金美;安同慶;趙鴻遠(yuǎn);劉益民;陳家锃;冷超糧;孫艷;常丹;田志軍;童光志;;豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年01期

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3 袁慶志;禮卓然;南錫;吳裕祥;李亞香;;豬偽狂犬病病毒的分離與鑒定[J];中國(guó)畜禽傳染病;1987年03期

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1 葉超;豬偽狂犬病病毒HeN1株全基因組測(cè)序與病毒遺傳變異分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

本文編號(hào)：2666313