【摘要】：乳酸桿菌為應用最早、研究最多的益生菌種之一,廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖。但是,目前研究集中于菌種篩選和應用效果評價,而乳酸桿菌特別是其成分和培養(yǎng)上清對動物腸道的實際免疫調節(jié)效應未引起足夠關注。本研究旨在解析鼠李糖乳酸桿菌(LGG)和羅伊氏乳酸桿菌(ZJ617)組成成分與代謝產物(培養(yǎng)上清)對脂多糖(LPS)致敏小鼠腸道免疫和屏障功能、肝臟炎癥的緩解調節(jié)作用,解析乳酸桿菌益生調節(jié)機制。1)體外細胞試驗研究:構建LPS致敏的小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)炎癥模型,分析LGG不同成分(SLP、CpG和DNA)和及其代謝產物預處理對細胞的免疫調控作用。結果顯示:與對照組組比較,SLP與CpG或DNA組合可顯著抑制LPS誘導的ERK1/2的磷酸化,優(yōu)于SLP、CpG和DAN單獨使用的效果。乳酸桿菌無細胞上清液(LGGs和ZJ617s)預處理細胞,顯著抑制LPS誘導的LC3表達、ERK1/2和mTOR的磷酸化升高,同時提高抑制信號分子I-κBα表達,發(fā)揮抑制緩解炎癥作用。2)動物試驗研究(腸道):以連續(xù)灌胃乳酸桿菌無細胞上清液LGGs和ZJ617s兩周后(劑量為0.2ml/天,劑量相當于用10~9的LGG和ZJ617菌體處理),腹腔注射LPS,致敏24小時后,屠宰采集血清、肝臟和腸道樣品。采用免疫印跡Western blot、免疫熒光、ELISA、代謝組學方法,分析乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對回腸的免疫調節(jié)效應和對肝臟的保護作用。1)腸道組織結果顯示:LPS刺激后,小鼠回腸通透性增加,絨毛高度降低,TLR4、LC3、Atg5、Caspase-3和SOD2表達量均顯著上調;LGGs和ZJ617s干預后,腸道屏障功能恢復到正常水平,蛋白的表達與對照組無顯著差異。2)回腸內容物代謝組學分析顯示,Con組與LPS組之間總共有35個差異代謝物(33個上調,2個下調);LPS組與LPS+ZJ617s組相比,共有16個差異代謝物,均顯著降低;三組之間比較共有10個差異代謝物。3)動物試驗研究(肝臟):腸道屏障功能和穩(wěn)恒,進一步會影響肝臟功能,存在肝腸軸,為此,動物試驗同上,進一步分析乳酸桿菌上清液LGGs和ZJ617s對LPS刺激小鼠肝臟功能的影響。小鼠肝組組織病理切片顯示,ZJ617s和LGGs組明顯改善LPS致敏小鼠肝炎中的肝小葉結構。LPS刺激后小鼠血清D-木糖和二胺氧化酶(DAO)水平顯著升高,而ZJ617s和LGGs處理恢復其值正常水平。LPS刺激導致Claudin3、Occludin和ZO1蛋白表達下調,ZJ617s預處理后回歸正常水平。炎癥信號通路分析顯示,LPS刺激導致肝臟TLR4顯著增加,ZJ617s和LGGs處理使其蛋白表達回歸正常水平;LPS刺激顯著提高了p38、ERK和JNK的磷酸化水平,而ZJ617s和LGGs預處理組磷酸化水平恢復至正常水平。自噬信號通路分析顯示,LPS刺激引起肝臟自噬信號通路的關鍵蛋白Atg5和LC3顯著升高,引發(fā)過度自噬,而ZJ617s和LGGs預處理顯著降低LPS的刺激誘發(fā)的過渡自噬。凋亡信號通路分析顯示,LPS刺激顯著增加小鼠肝臟凋亡通路上的SOD2和Caspase3蛋白的表達量,ZJ617s和LGGs的處理使其蛋白表達回歸到正常水平。因此,乳酸桿菌LGG的有效成分SLP+CpG和SLP+DNA能顯著緩解LPS誘導的炎癥反應。LGGs和ZJ617s干預,使LPS刺激小鼠腸道屏障功能恢復到正常水平。乳酸桿菌上清液通過抑制TLR4-MAPK-NF-κB炎癥信號通路、自噬和凋亡信號通過,緩解LPS誘導肝臟損傷。
【圖文】：

圖2.1不同時間點的LPS對RAW264.7細胞蛋白表達水平的影響Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 對 LPS 致敏的 RAW264.7 細胞的免疫調節(jié)作用構建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細胞系模型，選取 MOI=10 的 LGG 預處理細胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細胞 0.5 h，檢測 I-κB 表達量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。結果顯示，LPS 組的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，I-κB 蛋白表達量顯著降低。LGG預處理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平顯著下降，I-κB 蛋白表達量顯著升高。

圖2.1不同時間點的LPS對RAW264.7細胞蛋白表達水平的影響Fig2.1 Western blot analysis of MAPK and NF-κB activation in RAW264.7 cells stimulatedby LPS at different time points.Values are means ± SD, n=3. Different letters indicate thechange between eac h group is statistically significant (P < 0.05).2.2 LGG 對 LPS 致敏的 RAW264.7 細胞的免疫調節(jié)作用構建 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細胞系模型，，選取 MOI=10 的 LGG 預處理細胞 2 h，再用 200 ng/mL 脂多糖 LPS 刺激 RAW264.7 小鼠腹腔巨噬細胞 0.5 h，檢測 I-κB 表達量、ERK1/2 和其磷酸化水平、p38 和其磷酸化水平。結果顯示，LPS 組的 p38 和 ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，I-κB 蛋白表達量顯著降低。LGG預處理 2 h 后 p38 和 ERK1/2 的磷酸化水平顯著下降，I-κB 蛋白表達量顯著升高。
【學位授予單位】：浙江農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.2

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本文編號：2663990