發(fā)布時間：2020-05-14 12:50

【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)作為在世界范圍內(nèi)廣泛流行的重要食源性致病菌和共生菌,主要導(dǎo)致人或動物胃腸炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等,能引發(fā)其免疫損傷性疾病(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎和格林-巴利綜合征(GBS)等)。抗生素抗性基因(ARGs)能借助抗性元件進行遷移而被人體正常菌群、機會致病菌和病原菌所捕獲,而攜帶有ARGs的病原菌感染人體,將可能難以被治療,甚至無藥可救。當(dāng)前對多重耐藥的空腸彎曲桿菌研究十分有必要。基于課題組前期對華中地區(qū)家禽空腸彎曲菌流行病學(xué)的研究,表明空腸彎曲桿菌菌株(ST464CCs克隆群)形成生物膜的能力最強,且對各類抗生素的耐藥性整體偏高。然而,多重耐藥的空腸彎曲桿菌在感染臟器后的慢性感染過程中,引起抗生素抗性基因(ARGs)是否傳遞給機體內(nèi)其他細菌的過程不清楚。本研究提出假設(shè):多重耐藥的空腸彎曲桿菌感染肝臟慢性感染過程中,可引起ARGs傳遞給肝臟中的細菌,并引起微生物群落結(jié)構(gòu)改變。設(shè)計試驗如下:將80只昆明鼠隨機分成A、B、C、D四組,依次接種6×10~9CFU/ml、3×10~9 CFU/ml、1.5×10~9CFU/ml的菌液和布什肉湯,整個感染性試驗持續(xù)八周。通過觀察臨床癥狀、統(tǒng)計臨床積分、計算臟器指數(shù)、剖檢病理變化、病理切片、病理積分等相關(guān)性分析及致病性資料來有效評估自身免疫性病理損傷模型,探究肝臟損傷的特征性變化;通過微生物qPCR DNA芯片檢測ARGs的種類;構(gòu)建intI1、tnpA、16S rRNA克隆文庫,結(jié)合qPCR對ARGs進行豐度定量,探究ARGs在肝臟呈現(xiàn)出的時空分布特征;利用16S rRNA巢式PCR擴增及高通測序技術(shù)手段對肝臟樣品中微生物群落進行分析,揭示ARGs在機體肝臟內(nèi)的遷移方式和ARGs分布特征。主要的研究結(jié)果如下:(1)空腸彎曲桿菌感染昆明鼠自身免疫性損傷病理模型的建立。據(jù)實驗所得最佳建模條件,實驗設(shè)定每周一到周天上午八點和下午六點對各組鼠觀察,A組高濃度、B組中濃度菌液劑量感染昆明鼠后,表現(xiàn)出活動力減弱、呼吸出現(xiàn)急促、身體略微顫抖、雙后肢行動弱、腹部皮毛凌亂等臨床上的癥狀,比C組的低劑量濃度感染的臨床癥狀明顯,臨床癥狀評分可達4-5分。低劑量組的昆明鼠輕微脫毛現(xiàn)象,未見明顯活動異常,臨床癥狀評分為0分。每周二上午八點定時對各濃度組昆明鼠剖檢,其剖檢主要病變是在腸系膜處,小腸有積液;肝、脾臟與對照組對比有明顯腫大,有炎癥,與臨床上感染癥狀是相符合的;組織病理切片顯示在肝上的中央靜脈排列不規(guī)整,肝細胞內(nèi)有損傷病變,盲腸區(qū)域,黏膜有輕微的壞死脫落,其固有層顯示充血。實驗結(jié)果表明空腸彎曲桿菌ST464對昆明鼠進行腹腔接種不同劑量后,引起不同時間點臟器指數(shù)顯著的特征性變化,特別脾臟及肝臟表現(xiàn)出的明顯特征性變化,小腸的特征性輕微明顯;而心臟、肺、腎臟等沒有表現(xiàn)出明顯的特征性變化,這極可能與各器官的功能作用有很大關(guān)系。通過免疫損傷性病理模型,引起了昆明鼠肝臟的彌散性慢性感染。(2)空腸彎曲桿菌感染肝臟中抗生素抗性基因在不同濃度和不同時間點的分布特征。在實驗室條件下,根據(jù)高中低三個濃度的菌液和布什肉湯(對照組)對昆明鼠攻毒且連續(xù)八周時間取樣分析。利用微生物qPCR DNA芯片共檢測出10種耐藥基因,分屬為β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類三大類抗生素的抗性基因,占比分別是73.97%、23.25%、2.77%。由Sperman相關(guān)系數(shù)分析,int/tnpA豐度呈現(xiàn)正向顯著性關(guān)系,p0.05;整合子intI1基因和tnpA在ARGs的傳播過程中,對ARGs捕獲及其水平轉(zhuǎn)移的起關(guān)鍵性的作用;抗性基因ermB與肝臟指數(shù)(Liver index)呈現(xiàn)正向顯著性關(guān)系,p0.05;即分析ermB基因在慢性感染過程中,對肝臟的病理變化有明顯的作用。放線菌門(Actinobacteria)與SHV(β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因)呈現(xiàn)正向顯著性關(guān)系。通過Adonis分析,R~2=0.49531表示分組對差異的解釋度越高;P0.02,說明本次檢驗的可信度高,大多數(shù)相近的樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)相似度是相對較高的。由16S rRNA Miseq高通量測序結(jié)果表明,在三組高中低濃度多重耐藥的空腸彎曲桿菌感染過程中,在微生物群落的門水平上物種類別,變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acidobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)在微生物群落中作為最主要的菌群,其豐度分別是38.73%、33.23%、19.7%,占微生物總量的91.66%,其他物種的差異不是很明顯;在微生物群落的屬水平上,紅球菌屬(Rhodococcus)、無色桿菌屬(Achromobacter)、葡萄球菌(Staphylococcus)有表明是作為共同的優(yōu)勢屬類,除了優(yōu)勢屬類外,其他物種變化有一定差異。高濃度組的多重耐藥的空腸彎曲桿菌對機體的慢性感染過程中,會在一定程度上降低其微生物的多樣性和豐度,這可能就是在微生物群落中一定程度上能對抗性優(yōu)勢菌群的生長繁殖有促進作用。綜上,本研究對多重耐藥的空腸彎曲桿菌ST464感染肝臟的慢性過程中,肝臟上的3大類抗生素10種ARGs在時空上的特征,初步表明了動物有機體中肝臟指數(shù)和微生物群落對ARGs的影響,引起了ARGs傳遞給肝臟中的細菌及對微生物群落結(jié)構(gòu)改變起到促進作用,為今后控制ARGs的傳播在一定程度上提供更多可能的數(shù)據(jù)支撐。
【圖文】：

株菌間進行轉(zhuǎn)移，使接受菌獲得抗生素抗性的過程[47]。Luo 等已經(jīng)證RGs 存在于質(zhì)粒上，攜帶 ARGs 的質(zhì)粒經(jīng)接合作用可進行轉(zhuǎn)移，在間及不同種屬細菌間進行相互傳遞，甚至有些轉(zhuǎn)移也可發(fā)生在細菌。Rhodes 等的研究有發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素抗性基因能夠被質(zhì)粒等移動元件播，如可在微生物群落中的產(chǎn)氣單胞菌和大腸桿菌間相互轉(zhuǎn)移[49]。P 等基于其試驗研究表明，在自然界中的微生物，其 DNA 會因微生亡，進一步細胞壁出現(xiàn)破裂而被釋放，直接進入環(huán)境中并在一定自然存留[50][51]。因此，ARGs 也可以在不依賴環(huán)境中微生物宿主的轉(zhuǎn)移釋放出來，，污染環(huán)境并造成危害。整合子若位于染色體上，可由垂直著，其本身在不借助移動元件的條件下不能進行移動的，正是借著這傳給子代細菌[52]。

那么樣本中大量的基因就能同時被快速檢測出來圖 1-2。在生物體中，基因被轉(zhuǎn)錄并拼接（在真核生物A 轉(zhuǎn)錄本（圖中紅色標(biāo)記）。mRNA 從生物體中提取、穩(wěn)定的 ds-cDNA 中（圖中藍色標(biāo)記）。在微陣列中，ds記（圖中橙色標(biāo)記）。這些被標(biāo)記的片段與一組有序的起，并測量陣列中的熒光強度，熒光強度代表了一組預(yù)序列通常被選為目標(biāo)基因組的報道序列。
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

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本文編號：2663379