【摘要】：內(nèi)源小干擾RNA(endo-siRNA)是近年來在哺乳動物生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類新型小RNA,長度一般為20-22nt,能與AGO2蛋白結(jié)合,參與RNA干擾(RNA interference,RNAi)作用。Endo-siRNA的前體是雙鏈RNA(dsRNA),dsRNA在DICER的切割下產(chǎn)生endo-siRNA。目前研究表明,endo-siRNAs的來源包括轉(zhuǎn)座子、互補轉(zhuǎn)錄物和長發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(long hairpin RNA)等。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retrovirus,ERV)是一類重要的轉(zhuǎn)座子,在人類和小鼠基因組中分別占8%和10%,其對人和小鼠胚胎早期發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。ERV側(cè)翼具有長末端重復(fù)序列(Long terminal repeat,LTR)結(jié)構(gòu),具有啟動子和終止子的作用,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能形成dsRNA,可產(chǎn)生endo-siRNA。在本實驗室的前期工作中,采用小RNA高通量深度測序技術(shù),在豬合子中鑒定了大量endo-siRNAs。在本研究中,我們主要探索LTR來源的endo-siRNAs(LTR-siRNAs)對豬早期胚胎發(fā)育的影響。我們首先通過stem loop RT-PCR對高通量測序結(jié)果進行驗證,結(jié)果表明我們關(guān)注的LTR-siRNAs在豬合子中都有表達。在MII期卵母細(xì)胞中注射DICER的鎖核酸(LNA-iDICER),對Dicer進行有效敲低,發(fā)現(xiàn)LTR-siRNAs表達量也顯著下降,說明LTR-siRNAs的形成依賴于DICER。Endo-siRNAs來源于dsRNA,RNaseA處理可以降解單鏈RNA,但不影響dsRNA。設(shè)計LTR的熒光探針,進行RNA熒光原位雜交實驗(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測,結(jié)果在RNaseA處理組的胚胎中獲得較強的熒光信號,表明LTR的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可形成雙鏈。進一步發(fā)現(xiàn),通過注射LNA-iLTRs敲低合子期LTRs的表達水平,LTR-siRNAs的表達量也顯著下降,說明LTR-siRNAs來源于LTRs轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的dsRNA。為了闡述LTR-siRNAs在豬胚胎早期發(fā)育過程中對靶LTRs的調(diào)控作用,我們首先通過real-time PCR檢測豬早期胚胎發(fā)育各個時期LTRs和LTR-siRNAs的表達模式,結(jié)果表明在豬早期胚胎發(fā)育各時期LTR-siRNAs對LTRs的表達具有抑制作用。這一現(xiàn)象進一步通過在MII期卵母細(xì)胞中注射LTR-siRNAs的模擬物(mimics)和阻抑物(inhibitors)得到驗證。最后,我們通過在MII期卵母細(xì)胞中注射LTR-siRNAs的mimics和inhibitors以及LTR鎖核酸(LNA-iLTRs),檢測LTR-siRNAs及其靶LTRs對豬早期胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,LTR-siRNAs mimics和inhibitors及LNA-iLTRs注射組卵裂率、囊胚率都顯著下降,表明LTR-siRNAs通過調(diào)控靶LTRs的表達水平對豬胚胎早期發(fā)育具有顯著的調(diào)控作用。
【圖文】：

圖 1 果蠅、小鼠中 endo-siRNA 的生物發(fā)生過程e 1 The endogenetic process of endo-siRNA in drosopHila melanogaster an-siRNA 的來源

圖 2 endo-siRNA 的來源Figure 2 Source of endo-siRNAs.4.1 Endo-siRNA 來源于轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子的插入能引起基因組的突變，，因此需要強有力的機制限制轉(zhuǎn)座子的活性。在生
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

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本文編號：2663336