【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PED virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高死亡率為特征的一種高度接觸性腸道傳染病。2010年以來(lái),我國(guó)多地暴發(fā)的由變異毒株引起的PED,給養(yǎng)豬場(chǎng)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。以CV777減毒株為代表的活疫苗在臨床應(yīng)用較為普遍,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室診斷中無(wú)法快速區(qū)分野毒株與疫苗株。ORF3基因是PEDV的輔助基因,其部分片段的缺失可導(dǎo)致PEDV毒力減弱,也是鑒別PEDV強(qiáng)、弱毒株的重要靶標(biāo)。本研究以O(shè)RF3為靶標(biāo),旨在建立鑒別PEDV強(qiáng)、弱毒株的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan FQ-PCR)方法,為PED的診斷與防治提供重要技術(shù)支持。分別以PEDV CV777減毒株和變異強(qiáng)毒株(HBQY)的核酸序列為模板,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增PEDV ORF3全基因序列,回收的目的片段分別與pET-28a載體連接,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3。應(yīng)用PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ核酸內(nèi)切酶消化以及序列分析對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,證明構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒內(nèi)含有變異強(qiáng)毒株和減毒株的ORF3全基因。根據(jù)CV777減毒株和強(qiáng)毒株ORF3基因序列的差異,設(shè)計(jì)一條鑒別強(qiáng)弱毒株的TaqMan探針引物及一對(duì)特異性PCR用引物,以重組質(zhì)粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3為模板,通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,確立反應(yīng)體系,建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得了特異檢測(cè)PEDV強(qiáng)毒株的Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程,而不能檢測(cè)到PEDV減毒株核酸。對(duì)擴(kuò)增的核酸片段進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果擴(kuò)增片段與已知序列完全一致。建立的TaqMan FQ-PCR方法最低能檢測(cè)到3.7拷貝的病毒核酸以及7.96個(gè)TCID_(50)的病毒,與豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬瘟病毒等無(wú)交叉反應(yīng)。當(dāng)擴(kuò)增閾值(Cq值)36時(shí),結(jié)果判定為陽(yáng)性;若Cq≥36,則判定為陰性,批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于2.46%。進(jìn)一步應(yīng)用建立的TaqMan FQ-PCR檢測(cè)了38份腹瀉仔豬的小腸及其內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)等樣品,同時(shí)將待檢樣品接種到Vero細(xì)胞上,連續(xù)盲傳3代后,用間接免疫熒光方法(IFA)檢測(cè)PEDV。結(jié)果TaqMan FQ-PCR與IFA的PEDV陽(yáng)性檢出率分別為31.58%(12/38)和26.32%(10/38),表明前者的敏感性高于后者。上述結(jié)果表明,基于PEDV ORF3基因建立的TaqMan FQ-PCR能夠特異、敏感地快速鑒別檢測(cè)PEDV強(qiáng)毒株,可以為PED的快速檢測(cè)與防治提供重要技術(shù)手段。
【圖文】：

PEDV強(qiáng)弱毒株ORF3基因的差異Fig.2-1DifferenceofORF3geneinPEDVvirulentandattenuatedstrain
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

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1 李R，

本文編號(hào)：2663083