【摘要】：弓形蟲是一種專性寄生于真核細(xì)胞內(nèi)的原蟲。因弓形蟲感染而引起的弓形蟲病是一種重要的人獸共患病,廣泛流行于豬、羊、馬、狗、雞、貓以及人類等幾乎所有溫血?jiǎng)游�。貓及貓科�?dòng)物是弓形蟲業(yè)已發(fā)現(xiàn)的唯一終末宿主,其小腸組織是弓形蟲有性生殖的唯一場(chǎng)所。研究表明,弓形蟲感染貓8 h后,便會(huì)在小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)向配子發(fā)育,配子體和卵囊的形成持續(xù)4-6 d。人類誤食含有弓形蟲卵囊的食物或水是獲得弓形蟲病的主要途徑之一,可導(dǎo)致嬰兒、孕婦以及免疫功能低下者嚴(yán)重的臨床癥狀甚至死亡。但是,目前人們對(duì)弓形蟲在貓小腸組織內(nèi)的裂殖生殖及配子發(fā)育過程知之甚少,對(duì)弓形蟲在貓小腸組織發(fā)育成卵囊的分子機(jī)制尚不清楚。這嚴(yán)重制約著貓用弓形蟲新型疫苗與高效藥物的創(chuàng)制。本研究以弓形蟲感染早期貓的小腸組織為研究對(duì)象,對(duì)感染后不同時(shí)間段貓小腸組織的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行了研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為揭示弓形蟲早期配子發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。用弓形蟲PRU株的包囊經(jīng)口感染貍花貓,分別收取感染后第6 h、12 h、18 h、24 h、72 h、96 h及未感染的貓小腸組織,通過RNA-seq高通量測(cè)序和i TRAQ定量技術(shù),對(duì)弓形蟲感染早期貓小腸的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行測(cè)序與分析。1.弓形蟲感染早期貓小腸轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究共鑒定出2363個(gè)差異表達(dá)基因,與對(duì)照相比,感染6 h、12 h、18 h、24 h、72 h和96 h時(shí)的差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)分別為:56個(gè)、184個(gè)、404個(gè)、508個(gè)、400個(gè)和811個(gè)。上調(diào)表達(dá)的差異基因主要集中在D2、D3和E2染色體,下調(diào)表達(dá)基因主要集中在X染色體。GO分析顯示,在弓形蟲感染早期過程中,催化活性和代謝過程是富集最多的兩個(gè)生物學(xué)過程。KEGG信號(hào)通路分析表明,弓形蟲感染貓的各時(shí)間點(diǎn)均富集有大量的差異信號(hào)通路,在感染后96 h富集的通路最多。弓形蟲的感染還調(diào)控了MHC I遞呈、HSP結(jié)合和蛋白酶體應(yīng)答反應(yīng)等特殊信號(hào)通路的變化。另外,在差異表達(dá)基因中還富集了參與異生物質(zhì)代謝和阿爾茲海默癥過程的基因。2.弓形蟲感染早期貓小腸蛋白組學(xué)的研究共得到3401個(gè)可信蛋白,其中差異蛋白的總數(shù)為649個(gè),與對(duì)照相比,感染6 h、12 h、18 h、24 h、72 h和96 h時(shí)的差異蛋白個(gè)數(shù)分別為:76個(gè)、102個(gè)、85個(gè)、177個(gè)、262個(gè)和320個(gè)。差異蛋白的KEGG分析表明,弓形蟲感染貓的各時(shí)間點(diǎn)均富集有三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖類、脂肪和氨基酸)的代謝通路,提示在弓形蟲感染貓?jiān)缙?需要積累大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物。利用String數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)差異蛋白的相互作用進(jìn)行了預(yù)測(cè)。利用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel reaction monitoring,PRM)方法驗(yàn)證了蛋白組測(cè)序的質(zhì)量。PRM鑒定的6個(gè)蛋白與蛋白組測(cè)序結(jié)果一致,說明蛋白組測(cè)序結(jié)果可信度高。將轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,共得到184個(gè)差異表達(dá)基因。3.弓形蟲感染貓?jiān)缙诒磉_(dá)蛋白的反應(yīng)原性研究基于弓形蟲早期感染貓小腸蛋白組數(shù)據(jù),選取了7個(gè)弓形蟲蛋白進(jìn)行了表達(dá)水平的q RT-PCR驗(yàn)證,其中6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組顯著上升;在q RT-PCR驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,經(jīng)生物信息學(xué)分析,選取了其中的5個(gè)蛋白進(jìn)行了基因的克隆和原核表達(dá)。利用貓弓形蟲的陽(yáng)性血清對(duì)5個(gè)重組蛋白進(jìn)行了反應(yīng)原性的分析,r Tg Pr4蛋白反應(yīng)原性最強(qiáng),r Tg Pr6蛋白不具有反應(yīng)原性。本試驗(yàn)最后研究了以r Tg Pr4蛋白為診斷抗原,建立貓弓形蟲病ELISA診斷方法的可行性。結(jié)果表明,該蛋白可以作為診斷抗原建立貓弓形蟲病的ELISA診斷方法。
【圖文】：

圖 1.1 弓形蟲在貓小腸上皮細(xì)胞內(nèi)有性發(fā)育的過程Fig.1.1 Diagram representing the sexual development of Toxoplasma gondii in small intestinal epithelial cell of cat注：參考文獻(xiàn) Dubey & Speer, 2005Note：Reference Dubey & Speer, 2005

圖 2.1 皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析Fig. 2.1 Pearson’s correlation between samples未感染），，弓形蟲感染后第 6 h、12 h、18 h、24 h、72 h 和 96 h(control), 6, 12, 18, 24, 72 and 96 hours post-infection
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.293

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本文編號(hào)：2660225