【摘要】：支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是一種呼吸道病原菌,可廣泛感染多種動(dòng)物引起呼吸道疾病,尤其是在動(dòng)物免疫力較低的情況下,容易與其它病原形成混合感染,導(dǎo)致更為嚴(yán)重的疾病。對(duì)養(yǎng)豬業(yè)而言,Bb單獨(dú)感染主要引起豬支氣管肺炎或非進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Non-progressive atrophic rhinitis,NPAR),與產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌共感染可引起進(jìn)行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR),降低豬只飼料轉(zhuǎn)化率,使得豬只生長緩慢,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。噬菌體(Bacteriophage)是一類特異性感染細(xì)菌的病毒。根據(jù)噬菌體的寄生方式可將噬菌體分為裂解性噬菌體與溶原性噬菌體。裂解性噬菌體主要用于臨床防治多重耐藥菌的感染,因溶原性噬菌體具有整合到宿主菌的特性,可改變宿主菌的一些性狀,故不用于致病菌的防治。本研究旨在從我國規(guī)�；i場中分離支氣管敗血波氏桿菌并對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性分析,了解Bb近兩年的耐藥情況,為指導(dǎo)臨床用藥奠定基礎(chǔ)。并選用臨床分離的Bb作為指示菌進(jìn)行相關(guān)噬菌體的分離鑒定,為進(jìn)一步研究支氣管敗血波氏桿菌噬菌體奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:1.豬源支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定在2016~2018年期間,從我國廣東、貴州、四川、河南、湖北、福建、河北、江西、山西、內(nèi)蒙古、湖南等地的1735份病死豬肺臟組織中共分離到119株Bb,分離率為6.86%。將臨床分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定,結(jié)果顯示Bb對(duì)磺胺甲惡唑、甲氧芐啶敏感性低,對(duì)慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星、多粘菌素B敏感性較高;耐藥基因以sul2檢出率較高,同時(shí)檢測(cè)到目前國外未報(bào)道的sul3基因。2.支氣管敗血波氏桿菌噬菌體PHB09的生物學(xué)分析采用傳統(tǒng)的雙層平板法,從湖北省某豬場污水中分離到三株支氣管敗血波氏桿菌噬菌體,將其中一株以Bb01為指示菌分離到的噬菌體命名為vB_BbrS_PHB09。PHB09在平板上形成形狀不規(guī)則、渾濁的噬菌斑。經(jīng)電鏡觀察確定PHB09有一正多面體的頭部,約62.8±1.5 nm,以及一個(gè)長的不收縮的尾部,長約177.7±2.3 nm,寬約7.6±2.5 nm。由此可知,PHB09屬于有尾噬菌體目,長尾噬菌體科。PHB09能裂解89株Bb(n=119),而不能裂解其它種屬的細(xì)菌,如莢膜A型和D型多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌DH5α。將PHB09進(jìn)行全基因組測(cè)序分析,結(jié)果表明,PHB09基因組為雙鏈線性DNA,基因組長度大小42,129 bp,G+C含量62.8%。預(yù)測(cè)到PHB09共59個(gè)編碼區(qū)(CDS),其中25個(gè)CDS為功能性蛋白,其它34個(gè)CDS為未知蛋白。通過tRNAscan-SE預(yù)測(cè)到一個(gè)tRNA-Met-CAT。另外預(yù)測(cè)到PHB09含有一個(gè)整合酶基因及溶原模塊。通過噬菌體末端大亞基進(jìn)化樹分析可知,PHB09處于一個(gè)獨(dú)立的分支,為一株新型噬菌體。3.整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01的表型特征分析通過測(cè)序可知,PHB09為溶原性噬菌體,根據(jù)PHB09的溶原特性,篩選出一株整合PHB09基因組的細(xì)菌,命名Bb01+,將整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01進(jìn)行基因組測(cè)序比對(duì)分析,找到PHB09唯一的一個(gè)整合位點(diǎn)。將整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01分別測(cè)定一步生長曲線,發(fā)現(xiàn)兩者在體外培養(yǎng)無明顯差異,表明PHB09整合到宿主菌后不影響宿主菌的生長。將整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01稀釋到0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛冗M(jìn)行藥物敏感性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)兩者的MIC結(jié)果無顯著差異,且未預(yù)測(cè)到PHB09攜帶耐藥基因,表明PHB09整合到宿主菌后不改變宿主菌的耐藥性。4.整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01的致病性研究將菌株進(jìn)行血清抗性試驗(yàn)檢測(cè)。整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01與小鼠血清分別于37℃作用1 h、2 h。結(jié)果表明,整合菌株Bb01+對(duì)血清的敏感性高于親本菌株Bb01對(duì)血清的敏感性,說明整合菌株Bb01+更容易被血清清除。使用鼠源巨噬細(xì)胞(RAW264.7)以10:1(細(xì)菌:細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞吞噬試驗(yàn)。在相同作用時(shí)間下,整合菌株Bb01+對(duì)吞噬細(xì)胞的抗吞噬能力低于親本菌株Bb01。表明整合菌株Bb01+更容易被吞噬細(xì)胞吞噬。使用人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)以100:1(細(xì)菌:細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞黏附與侵入試驗(yàn)。與親本菌株Bb01相比,整合菌株Bb01+的黏附能力和侵入能力都降低,表明PHB09整合到宿主菌后降低了宿主菌的黏附與侵入能力。將整合菌株Bb01+與親本菌株Bb01分別以10~7、10~8 CFU劑量滴鼻接種5周齡BALB/c小鼠,記錄死亡情況并計(jì)算MLD。結(jié)果顯示,2×MLD劑量的整合菌株Bb01+對(duì)小鼠不致死。說明PHB09整合到宿主菌后大大降低了宿主菌的致病性。
【圖文】：

圖 4-3 豬源 Bb 的 PCR 鑒定Fig. 4-3 PCR identification of BbL2000 DNA Marker 1-7: PCR identifica8: Positive control 9: Negative contr

圖 4-1. 支氣管敗血波氏桿分離省份Fig.4-1 The provicen of isolated Bb strains圖 4-2 Bb 在 TSA+血清平板上的生長Fig.4-2 The growth of Bb on the TSAserum agar
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2659111