本文關(guān)鍵詞：豬弓形蟲感染ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)簡(jiǎn)稱弓形蟲是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。它可引起嚴(yán)重的人畜寄生蟲病并呈全球性分布及流行。弓形蟲的終末宿主是貓及貓科動(dòng)物,但是其中間宿主包括的動(dòng)物種屬卻較多,其中豬就是其中間宿主之一,并且豬弓形蟲的感染率及死亡率也較高。在我國豬弓形蟲病的分布地區(qū)也較廣,豬肉在我國的消費(fèi)比例較高,已經(jīng)成為人感染弓形蟲的重要來源。這就給養(yǎng)豬業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重的危害。但目前對(duì)弓形蟲病還沒有特效的治療藥物和有效疫苗。因此,建立一種方便、快捷的豬弓形蟲病診斷方法尤為重要。目前用于弓形蟲病診斷的方法有很多,如病原學(xué)診斷(檢測(cè)結(jié)果確實(shí)、可靠,但是耗時(shí)、檢出率低)、分子生物學(xué)診斷(敏感性高,但對(duì)儀器、人員要求較高)和免疫學(xué)診斷(操作簡(jiǎn)單、敏感特異、結(jié)果判定直觀)。本研究應(yīng)用免疫學(xué)診斷方法對(duì)弓形蟲病進(jìn)行檢測(cè)其主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.弓形蟲SAG3成熟肽基因的克隆、原核表達(dá)及鑒定根據(jù)Gen Bank AF340227已經(jīng)發(fā)表的弓形蟲表面抗原SAG3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,PCR擴(kuò)增SAG3基因片段。經(jīng)Eco R?、Hind???雙酶切后克隆到原核表達(dá)載體p ET-28a中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-SAG3并將其轉(zhuǎn)化至BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE顯示p ET-28a-SAG3主要以包涵體的形式存在。Western blotting分析該重組蛋白能被豬弓形蟲陽性血清識(shí)別,反應(yīng)原性較好。2.豬弓形蟲抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用利用純化的SAG3蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法,并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果顯示:最佳蛋白包被濃度為31.25ng/孔,以5%脫脂奶粉為最佳封閉劑,被檢血清稀釋度為1:320,酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1:3000。該方法的靈敏性試驗(yàn)中,血清稀釋度在1:6400時(shí)仍判為陽性;該方法批內(nèi)、批間重復(fù)的變異系數(shù)分別小于3%,12%重復(fù)性較好;采用該方法對(duì)8份陽性血清進(jìn)行檢測(cè)均為陽性,對(duì)吉林地區(qū)某豬場(chǎng)94份豬的待檢血清以及廣東地區(qū)某豬場(chǎng)54豬血清進(jìn)行檢測(cè),陽性率分別為8.51%(8/94)、46.29%(25/54)。3.豬弓形蟲感染雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用利用實(shí)驗(yàn)室已制備的抗弓形蟲重組蛋白SAG3單克隆抗體(Anti-A-SAG3-7和Anti-A-SAG3-23)建立雙抗夾心ELISA方法并對(duì)各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示:Anti-A-SAG3-7作為捕獲抗體包被的最佳稀釋度為1:3200,豬弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)陽性參照血清的最佳稀釋度為1:80,最佳封閉液為1%BSA,HRP-Anti-A-SAG3-23的最佳稀釋倍數(shù)為1:3200。該方法敏感性達(dá)1:640,并且此方法與兩份豬囊蟲陽性血清無交叉反應(yīng),計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11%,表明所建立的雙抗夾心ELISA方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。檢測(cè)廣東、吉林某地各94份待檢血清,結(jié)果陽性率分別為20.2%(19/94)、11.7%(11/94)。4.豬弓形蟲感染免疫膠體金試紙條的研制及初步應(yīng)用利用檸檬酸三鈉還原法制備40nm粒徑的膠體金溶液,標(biāo)記抗弓形蟲重組蛋白SAG3的單克隆抗體(Anti-A-SAG3-7)并對(duì)其標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化,用另一株抗SAG3的單克隆抗體(Anti-A-SAG3-23)和羊抗小鼠Ig G抗體分別包被硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(T線)與質(zhì)控線(C線)。組裝試紙條并優(yōu)化其檢測(cè)條件。對(duì)試紙條的性能進(jìn)行測(cè)試并檢測(cè)待檢樣品。結(jié)果如下:每毫升膠體金溶液的最適PH值是加入4μl 0.2M/L K2CO3,抗體的最佳標(biāo)記量為12μg。T線與C線的最佳包被濃度均為0.25mg/m L,最佳包被體積均為0.8μl。該方法的敏感性達(dá)1:160;與兩份豬囊蟲陽性血清無交叉反應(yīng);穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明,試紙條置于4℃和室溫分別可保存3個(gè)月、1個(gè)月有效。分別對(duì)廣東、吉林地區(qū)某豬場(chǎng)各94份豬待檢血清進(jìn)行檢測(cè),陽性率分別為18.08%(17/94)、10.63%(10/94)。利用膠體金試紙條與雙抗夾心ELISA法做對(duì)比檢測(cè)同一批樣品,兩者的符合率分別為89.47%,90.90%,兩種方法的符合率較高。結(jié)果表明,膠體金免疫層析法具有敏感、特異,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因而,本研究更適用于廣大基層單位對(duì)時(shí)間緊、樣品數(shù)量大的檢測(cè),為豬弓形蟲病的早期診斷提供了一種快捷、實(shí)用的方法。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 SAG3 原核表達(dá) ELISA 膠體金
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-22
• 第一章 弓形蟲診斷研究進(jìn)展14-22
• 1 弓形蟲病診斷方法14-22
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容22-66
• 第一章 弓形蟲表面抗原SAG3基因的原核表達(dá)與鑒定22-35
• 1.1 材料與方法22-30
• 1.2 結(jié)果30-33
• 1.3 討論33-34
• 1.4 小結(jié)34-35
• 第二章 弓形蟲SAG3蛋白抗體檢測(cè)ELISA方法的建立與初步應(yīng)用35-45
• 2.1 材料與方法35-38
• 2.2 結(jié)果38-42
• 2.3 討論42-43
• 2.4 小結(jié)43-45
• 第三章 雙抗夾心ELISA檢測(cè)豬弓形蟲血清循環(huán)抗原方法的建立與初步應(yīng)用45-52
• 3.1 材料與方法45-47
• 3.2 結(jié)果47-50
• 3.3 討論50-51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 第四章 豬弓形蟲病免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制及初步應(yīng)用52-66
• 4.1 材料與方法52-58
• 4.2 結(jié)果58-64
• 4.3 討論64-65
• 4.4 小結(jié)65-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-76
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介76-78
• 作者簡(jiǎn)介78-79
• 致謝79

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：豬弓形蟲感染ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：265838