【摘要】：CYP2J酶在機體內(nèi)源性物質(zhì)和外源性化合物代謝過程中扮演著非常重要的作用,一直是藥理學(xué)與毒理學(xué)的研究重點。本研究的主要目的是克隆雙峰駝CYP2J全長cDNA序列,進一步預(yù)測該基因完整開放閱讀框編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能,并對其編碼蛋白進行原核表達。實驗首先根據(jù)雙峰駝CYP2J基因已知的部分片段設(shè)計特異性引物,采用RACE技術(shù)克隆雙峰駱駝CYP2J cDNA 3'和5'序列。通過DNAMAN軟件拼接CYP2J cDNA 3'和5'序列的片段,獲得雙峰駝的CYP2J的全長cDNA序列。隨后通過DNAMAN、MEGA 6和ProtParam等多種生物信息學(xué)軟件分析CYP2J蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及進化關(guān)系。最后使用pET-21a(+)作為融合表達載體,構(gòu)建含有CYP2J編碼序列的重組質(zhì)粒pET21a-CYP2J,并誘導(dǎo)其在大腸桿菌BL21中表達。使用SDS-PAGE和Western Blot分析CYP2J蛋白的表達及純化情況。結(jié)果表明,本實驗成功獲得了雙峰駝CYP2J的cDNA的全長。其全長1770 bp,含有8 bp的5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)和253 bp的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)及1509 bp的完整開發(fā)閱讀框,共編碼502個氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析表明其編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測分子量為57.98 kD、等電點值為8.45、分子式為C_(2645)H_(4099)N_(713)O_(726)S_(15.)。且該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì),不具有信號肽,但有一個跨膜區(qū)域(12-35aa),主要錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。進一步的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該蛋白與羊和牛的CYP2J具有最接近的遺傳關(guān)系,它們都具有一個細胞色素P450家族中共有的血紅素結(jié)合基序FxxGxRxCxG/A。原核表達結(jié)果表明,0.5 mM IPTG在大腸桿菌BL21中37℃誘導(dǎo)6 h后,可實現(xiàn)CYP2J蛋白高效表達。總之,本研究成功獲得了雙峰駝CYP2J基因cDNA全序列,通過生物信息學(xué)分析了ORF的編碼蛋白的性質(zhì),并進一步表達了其蛋白,為下一步抗體制備以及雙峰駝CYP2J蛋白層面的表達分布奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

存在于絕大多數(shù)的細胞色素 P450 中，無論是在其保守。而這一保守序列并不存在于其它類型的蛋白鑒定和區(qū)分細胞色素 P450[24-27]；② WXXXR序列，列，它是位于細胞色素 P450 N 端的一段保守序列，TT/S序列，位于細胞色素 P450 的活性中心，在許一序列，其主要與細胞色素與氧分子和或底物分，位于血紅素近側(cè)，參與穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的作用[28]；因家族保守序列，主要位于細胞色素 P450 的“Me色素 P450 作用機制 P450 酶系可以催化的反應(yīng)類型多種多樣，常被人反應(yīng)可涉及多個過程。其中，最經(jīng)典的過程是在 N系統(tǒng)將分子氧還原為水并將一個氧原子加到底物中RH+O2+NADOH+H+ROH+H2O+NADP+

雙峰駝 CYP2J 基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其原核表達.4.2 RACE 技術(shù)原理RACE 技術(shù)是利用已知部分 cDNA 序列分別向 3'和 5'端擴增未知的序列，有兩分組成，即 3'RACE 和 5'RACE。'RACE：真核生物 mRNA 末端都有一段 poly 尾巴，，以此尾巴設(shè)計結(jié)合引物 3'-CDSrimer A，隨后將目的基因的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA。3'RACE 的引物包錨定引物以及特異性引物。錨定引物是試劑盒附帶的引物包括 10×Universalrimer A Mix (UPM)和 Universal Primer Short，根據(jù)已知序列設(shè)計出的基因特異性引 GSP1 和 NGSP1。然后以以合成的 cDNA 為模板，使用引物 10×Universal Primer Aix (UPM)和 GSP2 進行第一輪 PCR 的擴增（圖 2）。如瓊脂糖凝膠電泳檢測無目條帶，再利用 Universal Primer Short 和 NGSP2 進行巢式 PCR 擴增，從而得到 3未知序列。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S824

【參考文獻】

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本文編號：2657815