【摘要】：包涵體肝炎(Inclusion Body Hepatitis,IBH)是由I群禽腺病毒(Fowl adenovirus I,FAV-1)引起的以侵害肝臟為主的家禽傳染性疾病。該病的典型癥狀為心包積水、壞死性肝炎,主要感染3~6周齡的肉仔雞,致死率高達(dá)80%。該病一旦發(fā)生,便可迅速向周圍地區(qū)蔓延。近年來,在我國多個(gè)省市均有該病發(fā)生的報(bào)道,給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,加強(qiáng)對(duì)該病的研究有助于促進(jìn)我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究利用PCR方法從山東、江蘇、陜西、河北等家禽養(yǎng)殖場送檢的疑似“包涵體肝炎”的患禽肝臟組織中檢測禽腺病毒,進(jìn)行病毒分離以及Hexon基因測序,以了解我國部分地區(qū)I群禽腺病毒血清型的分布和感染狀況。同時(shí)利用建立的PCR-HRM方法對(duì)分離的腺病毒實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速的基因分型,該方法可作為開發(fā)其他病原體基因分型技術(shù)的模型。本研究首先通過SPF雞胚以及雞胚肝細(xì)胞(CEL)兩種分離方式對(duì)臨床疑似腺病毒感染的肝臟組織進(jìn)行病毒分離,通過PCR檢測、血凝性鑒定、Hexon基因序列測定與分析等試驗(yàn)對(duì)病毒分離株進(jìn)行鑒定。病料組織勻漿上清液接種SPF雞胚后能導(dǎo)致胚體發(fā)育不良,體表潮紅、出血,肝臟壞死、腫大,死亡高峰在接種后的6~7d;病料組織勻漿上清液接種雞胚肝細(xì)胞(CEL),48h后部分細(xì)胞開始變圓、皺縮,72h后70%~80%的細(xì)胞開始脫落,呈葡萄樣聚集,以上結(jié)果與報(bào)道的I群禽腺病毒的感染特性相符。PCR鑒定結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶與預(yù)期大小一致。共分離到15株I群禽腺病毒,分別命名為SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160402、SD160318、SD160827、SD160720、SX160723、SD160826、SD160829、SD160930。并測定15株分離毒株的TCID_(50),分別在10~(-4.15)~10~(-7.5)之間。血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示分離毒株均無血凝性。采用PCR方法對(duì)15個(gè)分離毒株的Hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增,并與GenBank中發(fā)表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,15個(gè)分離株中有10株與血清1型同源性較高,5株與血清4型同源性較高。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示SD160827、SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160401和SD160318分離株與血清1型禽腺病毒在同一分支上,其余分離株與血清4型禽腺病毒在同一分支上,說明15株FAV-I分離株可分為2個(gè)血清型,其中血清1型10株,血清4型5株。根據(jù)GenBank中發(fā)表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列,設(shè)計(jì)一條特異性引物,用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和隨后的高分辨率熔解(High Resolution Melting,HRM)曲線分析,并確立了它在區(qū)分12種FAdV參考血清型方面的能力。將結(jié)果與之前的Hexon基因PCR結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果表明,PCR-HRM是區(qū)分I群禽腺病毒12種血清型的一種靈敏而特異的方法。所有的熔解曲線都具有高度的可重復(fù)性,使用歸一化HRM曲線,每個(gè)血清型的復(fù)制都得到了正確的基因分型。本研究建立的I群禽腺病毒PCR-HRM檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好,可用于FAV-1的快速檢測。
【圖文】：

圖 1 腺病毒衣殼結(jié)構(gòu)（Chiocca et al., 1996）Fig. 1 Capsid structure of adenovirus (Chiocca et al., 1996).3禽腺病毒理化特性禽腺病毒的病毒粒子為不含有脂質(zhì)的囊膜，因此對(duì)酚類、乙醚、脫氧膽脂酸、氯、胰蛋白酶及 5%的乙酸等常規(guī)化學(xué)試劑均不敏感。此外，該類病毒具有一定的耐熱，室溫下可存活 6 個(gè)月左右，干燥情況下 25℃可存活 7 天，60℃條件下加熱 30m 50℃加熱 1h均可存活，但當(dāng)有雙價(jià)陽離子存在時(shí)，可明顯降低禽腺病毒的耐熱性，，且，于 60℃條件下加熱 1h、80℃加熱 10min 或 100 ℃加熱 5min 可使該病毒失去活（陳雪妓, 2016）。腺病毒對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿不耐受，耐受范圍在 pH3～9（Gelderblom , 1982），且最適 pH 為 5～6， 該 PH 條件下最適宜病毒復(fù)制。此外，在 1: 1000 的醛溶液中不穩(wěn)定，丙酮也可以使其失去活性。DNA 抑制劑 IuDR 和 BuDR 也可以抑病毒的增殖（Burmester et al., 1960）。大部分的腺病毒具有凝集相應(yīng)紅細(xì)胞的能，但不同群的腺病毒根據(jù)血清型差異，所能凝集的紅細(xì)胞種類也不盡相同。I 群禽腺

達(dá)到死亡高峰，死亡雞胚體表潮紅、出血、胚體蜷曲較小、甚至出現(xiàn)侏儒胚，剖檢可見脾腫大、肺水腫、肝臟斑點(diǎn)狀出血及肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核內(nèi)包涵體（圖 2）（Cowen etal., 1988）。I 群禽腺病毒各血清型都能在雞胚內(nèi)繁殖存活，但病毒的分離和胚體的病變會(huì)因接種方式的不同而不同，有研究表明，采用卵黃囊接種的方式較絨毛尿囊膜更容易分離到病毒（邱麗葉等, 2016）。采用 SPF雞胚進(jìn)行病毒分離時(shí)通常需要盲傳三代以使病毒適應(yīng)胚體環(huán)境，從而進(jìn)行良好的增殖，有些分離毒株在前三次傳代過程中雞胚的病變不明顯，也檢測不到病毒的存在，這或許與病毒的增殖方式有關(guān)。除了經(jīng)典的雞胚增殖分離方法外，還可以利用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，但因禽腺病毒一般不感染異種動(dòng)物，在異種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)生存繁殖能力較差，因此培養(yǎng)該病毒最好選用禽源細(xì)胞，如雛雞腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、原代雞胚肝細(xì)胞等，但成纖維細(xì)胞不引起細(xì)胞病變。用原代雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒時(shí)，一般 3～4d 內(nèi)出現(xiàn)遮光性減弱、細(xì)胞皺縮變圓成葡萄狀、細(xì)胞間隙距離增大、最終脫落死亡等特征。富強(qiáng)等研究表明雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)法優(yōu)于雞腎細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號(hào)：2657540