【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又被稱為藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的一種危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病,主要引起母豬的繁殖障礙、公豬的精液品質(zhì)下降、初生仔豬的死亡以及其它年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病。天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線,但在與宿主的共進(jìn)化過程中,病毒往往會發(fā)展各種機制抵抗宿主的天然免疫,達(dá)到成功感染的目的。以前的研究表明,PRRSV感染能夠拮抗I型干擾素(Interferons,IFNs)的產(chǎn)生,而且PRRSV編碼的多種蛋白,包括非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1,nsp2,nsp4,nsp11和結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白,具有拮抗干擾素產(chǎn)生的能力,但其分子機制尚不完全清楚。N蛋白是PRRSV編碼的核衣殼蛋白,也是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在PRRSV的感染、致病和免疫調(diào)節(jié)中扮演著十分重要的作用。本研究針對PRRSV N蛋白,探討其拮抗IFN-β產(chǎn)生的分子機制,主要研究內(nèi)容如下:1.超表達(dá)PRRSV N蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生和IRF3激活將PRRSV N蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,在仙臺病毒(Se V)的刺激下,采用IFN-β啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測IFN-β的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PRRSV N蛋白顯著抑制IFN-β的啟動子激活。IRF3是干擾素信號通路中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,我們采用同樣的策略分析了N蛋白對IRF3的影響,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)N蛋白也顯著抑制IRF3激活,并且呈劑量依賴性。2.PRRSV N蛋白作用于RIG-I/MDA5信號通路的靶點分析RIG-I/MDA5信號通路在RNA病毒激活干擾素產(chǎn)生中具有十分重要的作用。為了研究PRRSV N蛋白是否拮抗RIG-I/MDA5信號通路以及其作用的靶點,通過共轉(zhuǎn)染PRRSV N蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒和RIG-I/MDA5通路中各受體分子(RIG-I、MDA5)、接頭蛋白(IPS-1)、蛋白激酶(TBK-1、IKKε)和轉(zhuǎn)錄因子(IRF3)的真核表達(dá)質(zhì)粒,利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測IFN-β的啟動子活性。結(jié)果表明,PRRSV N蛋白可以拮抗RIG-I、MDA5、IPS-1、TBK-1、IKKε和IRF3介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活。更重要的是,PRRSV N蛋白還可以拮抗IRF3顯性突變體IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活,提示PRRSV作用RIG-I/MDA5通路的靶點在IRF3或IRF3下游。通過間接免疫熒光實驗進(jìn)一步分析了N蛋白的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)PRRSV N蛋白呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核穿梭分布,表明其具有在細(xì)胞核內(nèi)靶向IRF3的可能。3.PRRSV N蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵功能域分析為了確定PRRSV N蛋白抑制IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,通過IFN-β啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng),分別檢測了N蛋白的不同區(qū)域缺失突變體(6個N-端缺失突變體和5個C-端缺失突變體)抑制IFN-β產(chǎn)生的能力。結(jié)果顯示:PRRSV N蛋白的aa37-57和aa69-123是抑制Se V誘導(dǎo)的IFN-β激活的關(guān)鍵區(qū)域,而aa37-57正好包含N蛋白的核定位信號序列。
【圖文】：

2圖 1-2 PRRSV N 蛋白結(jié)構(gòu)圖解 (Music and Gagnon, 2010)Fig. 1-2 Schematic presentation of PRRSV nucleocapsid (N) proteinPRRSV N 蛋白的 C 端被認(rèn)為是二聚體結(jié)構(gòu)域 (Dimerization domain) (Spilm

圖 1-1 PRRSV 基因組組成 (Castelo et al., 2015)Fig. 1-1 PRRSV genome organization1.2 PRRSV N 蛋白簡介
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

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本文編號：2653061